Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
нет?
Б. Какую картину роста следует ожидать, если повторить тест с кружками,
используя Е. coli, зараженную мутантом 3?
B. Насколько возросла небольшая фракция фага Т4 дикого типа в
прозрачном пятне, образованном мутантом 5?
5-42 Вы выделили из животных клеток три разных вируса. Каждый из них
содержит одноцепочечную РНК в качестве генома. Чтобы
Прозрачное пятно (нет бактериального
Нормальный рост бактерйй
Неинфицированные клетки В.соИ К
Рис. 5-33.
вирусной клетках (:
Рис. 5-32. Тест с кружками для разных гп-мутантов (задача 5-41).
Клетки
Е. coli К, инфицированные мутантом 1
Клетки
Е. coli К, инфицированные мутантом 2
Основные генетические механизмы 37
Рис. 5-33. Разные формы ретровирусной ДНК в инфицированных клетках
(задача 5-43).
охарактеризовать, вы исследуете их с
помощью двух тестов. Во-первых, вы очищаете РНК-геномы этих вирусов и
определяете их способность служить мРНК в бесклеточной системе синтеза
белка. Во-вторых, вы измеряете активность их эндогенных полимераз, для
чего разрушаете мягким способом интактные вирусные частицы, затем
инкубируете их либо с радиоактивными рибо-нуклеозидтрифосфатами, чтобы
определить синтез РНК, либо с радиоактивными
дезоксирибонуклеозидтрифосфатами, чтобы определить синтез ДНК. Результаты
этого исследования представлены в табл. 5-2. Попробуйте на их основе
кратко описать жизненный цикл каждого вируса и назовите какой-либо
известный вирус с таким же циклом развития.
Таблица 5-2. Характеристика трех РНК-содержащих вирусов (задача 5-42)
Синтез белка Эндогенная полимераза
РНК ДНК
Вирус 1 _ +
Вирус 2 + --- ---
Вирус 3 + --- +
5-43 Когда ретровирусы заражают клетки,
их геном, представленный линейной молекулой РНК, копируется с
образованием линейной двухцепочечной ДНК при участии вирусного фермента -
обратной транскриптазы. Эта линейная ДНК содержит вирусные гены,
"вставленные" между двумя прямыми повторами, называемыми длинными
концевыми повторами, или LTR (рис. 5-33). Линейная ДНК может стать
кольцевой в результате гомологичной рекомбинации между LTR, при этом в
кольце будет содержаться один LTR, либо она может стать кольцевой в
результате сшивания концов, в этом случае в кольце будет содержаться два
LTR. Одна из форм внехромосомной ДНК встраивается в хромосому, и
образуется типичная интегрированная форма вируса, которая всегда содержит
два LTR, по одному с каждой стороны от вирусных генов.
Хотя точный механизм интеграции
неизвестен, делеция последовательностей на концах LTR препятствует
интеграции, что указывает на важную роль по крайней мере части структуры
LTR. Поскольку есть три формы неинтегрированной ДНК, то любая из них или
все три могли бы быть предшественниками интегрирован-
Интегрированный провирус
38 Глава 5
ной формы. Чтобы выяснить, какая форма является предшественником, для
заражения клеток были использованы три разных ретровирусных генома. Эти
геномы представлены в виде линейной ДНК на рис. 5-34; А-нормальный геном,
.Б-геном с одним внутренним LTR и В геном с двумя внутренними LTR,
ферментативно сшитыми конец в конец.
После заражения каждым геномом исследовали популяции клеток,
содержащих интегрированные вирусные геномы. Из трех клеточных популяций
выделяли хромосомную ДНК и обрабатывали ее диагностическими
рестриктазами, которые расщепляют вирусную ДНК, как показано на рис. 5-
34. Получившиеся фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в геле и
фрагменты, содержащие ДНК ретровирусов, исследовали методом гибридизации
с меченым зондом, специфичным для последовательностей ретровирусов. Эти
результаты представлены на рис. 5-34 справа. Те фрагменты, в которых
кроме последовательностей ретровирусов содержалась клеточная ДНК, на
рисунке не показаны.
Пользуясь этими данными, попытайтесь установить структуру
предшественника интегрированной формы вируса и объясните ваше решение.
Структура сконструированных ретровирусных геномов
-8 т.п.н.-
?
Электрофорез в геле интегрированных ретровирусов
? т
-8 т.п.н.-
0,4 т.п.н.
? т
Рис. 5-34. Структура сконструированных ретровирусных геномов и анализ
интегрированных форм генома после заражения (задача 5-43).
Диагностические сайты рестрикции указаны кружками и квадратами. Числа
обозначают длину сегментов ДНК в т.п.н.
-8 т.п.н,-
? т
р
р
