Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
фосфолипиде 1 нитроксильный радикал находится на его полярной голове и,
следовательно, в непосредственном контакте с внешней средой. Таким
образом, он может легко и быстро взаимодействовать с аскорбиновой
кислотой. В фосфолипиде 2 нитроксильный радикал присоединен к цепи жирной
кислоты и поэтому частично замаскирован в глубине мембраны. Вследствие
этого он менее доступен для действия аскорбиновой кислоты и
восстанавливается медленнее.
Б. Ключевой результат состоит в том, что степень снижения величины
сигнала ЭПР в присутствии и в отсутствие аскорбиновой кислоты в опытах с
вновь замкнутыми тенями эритроцитов одна и та же, а в опытах с
неповрежденными эритроцитами-нет. Из этого следует, что в цитоплазме
эритроцитов есть некий восстанавливающий агент, который восстанавливает
более доступный фосфолипид 1, но не может восстановить менее доступный
фосфолипид 2. Поэтому в интактных эритроцитах фосфолипид 2 стабилен в
отсутствие аскорбиновой кислоты, а в ее присутствии спин-мече-ные
фосфолипиды в наружном монослое восстанавливаются, что
приводит к потере половины сигнала ЭПР. С другой стороны, фосфолипид 1
не стабилен в интактных эритроцитах в отсутствие аскорбиновой кислоты,
потому что фосфолипиды во внутреннем монослое доступны действию
восстанавливающего цитоплазматического агента, который снижает сигнал ЭПР
наполовину. При добавлении аскорбиновой кислоты меченые фосфолипиды в
наружном монослое также восстанавливаются, вызывая потерю остального
сигнала ЭПР.
В. Результаты, представленные на рис. 6-3, позволяют заключить, что
меченые фосфолипиды были введены в оба монослоя плазматической мембраны
эритроцитов в равных количествах. Фосфолипид
2 был на 50% чувствителен (доступен) к действию аскорбиновой кислоты,
что указывает на присутствие половины метки в наружном монослое, и на 50%
нечувствителен, т. е. другая половина метки, не подверженная действию
аскорбиновой кислоты, находилась во внутреннем монослое. Количество
фосфолипида 1, чувствительного к цитоплазматическому восстанавливающему
агенту, составляло 50% от его общего количества, следовательно, половина
метки находилась во внутреннем монослое. Остальная половина молекул
фосфолипида 1 была доступна действию аскорбиновой кислоты, следовательно,
половина метки находилась в наружном монослое мембраны.
Литература: Rousselet, A., Guthmann, С., Matricon, JBienvenue, A.,
Devaux, P. F. Study of the transverse diffusion of spin labeled
phospholipids in biological {
membranes: I. Human red blood cells. Biochim. Biophys. Acta 426:
357-371, {
1976.
j
A. По данным этих экспериментов можно оценить полупериод транслокации,
если экстраполировать кривую на рис. 6-4 до точки, в которой сигнал ЭПР
снижается на 50%. Для клеток, меченных по внутреннему монослою, эти
данные дают величину полупериода транслокации около 7 ч. У клеток,
меченных по наружному монослою, полупериод транслокации гораздо больше,
но точность его оценки сомнительна. Эти данные показывают, что частота
перескоков фосфолипидов между двумя монослоями плазматической мембраны
эритроцита чрезвычайно низка. В экспериментах с искусственными бислоями
были получены еще большие полупе-риоды; действительно, в самых удачных
экспериментах, когда были приняты максимальные предосторожности против
окисления или иных повреждений липидов, частота перескоков была
неизмеримо более низкой (реже одного раза в месяц).
Б. Фосфолипид 2 был использован для мечения внутреннего монослоя, а
фосфолипид 1-для мечения наружного монослоя. Как следует из рис. 6-3,В,
фосфолипид 2 во внутреннем монослое не восстанавливается цитоплазмой
эритроцитов, а в наружном монослое может быть восстановлен аскорбатом.
Таким образом, фосфолипид 2 пригоден для измерения скорости транслокации
от внутреннего монослоя к наружному. Как следует из результатов,
приведенных на рис. 6-3,А, фосфолипид 1 во внутреннем монослое
восстанавливается цитоплазмой эритроцита, но, находясь в наружном
монослое, он стабилен в отсутствие аскорбата. Таким образом, фосфолипид 1
пригоден для измерения скорости транслокации от наружного монослоя к
внутреннему.
B. Можно получить интактные эритроциты, содержащие спин-мече-ные
фосфолипиды исключительно во внутреннем монослое. Процедура заключается
во введении фосфолипида 2 в мембрану
Плазматическая мембрана 315
эритроцитов и последующей инкубации в течение часа в присутствии
аскорбата. Последний восстанавливает липид в наружном монослое, не
затрагивая меченый липид, попавший во внутренний монослой мембраны
эритроцитов. Подобным же образом спин-меченый фосфолипид 1 можно ввести
исключительно в наружный монослой: мембрана эритроцитов метится этим
фосфолипидом, затем клетки инкубируют 15 мин в среде без аскорбата. При
этом спин-меченый фосфолипид 1 во внутреннем монослое восстанавливается
соединениями, присутствующими в цитоплазме, и метка остается только в
