Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
одинаковой частотой. Таким образом, сайт, узнаваемый Sau3A, будет
встречаться в среднем один раз на 256 п. н. в цепи ДНК. Сайт, узнаваемый
BamHI и состоящий из шести нуклеотидных пар, будет встречаться один раз
на 4096 п. н. ((1/4)6 - 4096) в случайной последовательности ДНК.
5-50
А. Сложность набора фрагментов после сшивания объясняется тем, что
соединяться могут любые два ВатШ-конца. Таким образом, при соединении
фрагментов длиной 0,4 т. п. н. может создаваться целый набор фрагментов с
размерами 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 т. п. н. и т. д.
Основные генетические механизмы 309
Рис. 5-59. Различные положения фрагментов 0,4 и 0,9 т. п. н., полученных
путем обработки BamHI, при образовании фрагмента 1,3 т.п.н. (ответ 5-50).
300
R1
1юо|
R1
200
700
2. | 300 ll00| |
R1 R1
3. |lQof 300 | | 200 I
R1
4 I1001 300 I I
R1
700
200
700
R1
700
200
EcoRI
I
BamHI
> *-!0,4I *-------'0,8
2,7
¦1,1
-1,9
¦2,5
¦3,0
-0,5
¦1,7
¦2,1
-3,4
Рис. 5-60. Карта рестрикции клонированного вами сегмента ДНК и продукты
частичного расщепления, по которым она составлена (ответ 5-50). Числа
рядом с фрагментами означают их длину, определение которой
проиллюстрировано на рис. 5-42.
Подобно этому, фрагменты длиной 0,9 т.п.н. будут соединяться с
образованием набора следующих фрагментов: 1,8; 2,7; 3,6 т.п.н. и др. И
наконец, комбинации двух фрагментов дадут третий набор фрагментов с
размерами 1,3; 1,7; 2,1; 2,2 т.п.н. и т.д. (Наблюдаемая картина
распределения часто еще более сложна, так как эти фрагменты при
соединении их концов могут образовывать кольцевые структуры.)
Б. Поскольку два любых ВатШ-конца способны соединяться между
собой, то могут возникнуть одинаковые по размеру, но различающиеся по
структуре фрагменты, как показано на рис. 5-59 для фрагмента размером 1,3
т.п.н. Обработка популяции фрагментов размером 1,3 т.п.н. рестриктазой
EcoRI приводит к образованию разнообразных фрагментов с размерами от 0,1
т. п. н. (см. левые концы структур 3 и 4, рис. 5-59) до 1,0 т.п.н. (см.
внутренние фрагменты структуры 4, рис. 5-59).
5-51 Принцип, на котором основан метод построения рестрикционных
карт, очень похож на тот, который используется при химическом
секвенировании ДНК. В обоих случаях молекулы метят на одном конце, затем
частично фрагментируют с помощью неполного расщепления в нескольких
специфических сайтах и, наконец, рас-| пределяют фрагменты по
размерам. Длина меченого фрагмента
указывает на расстояние от меченого конца до сайта, по
которому произошло расщепление.
Рестрикционная карта, полученная на основе радиоавтограммы,
изображенной на рис. 5-42, представлена на рис. 5-60, где она
сопоставляется с продуктами неполного расщепления, производи-J 3,7
мого одной рестриктазой (см. штриховые линии). Размеры рест-
риктов оценивают путем сравнения с набором маркерных
фрагментов на рис. 5-42. (Из рисунка видно, что расстояние, на которое
мигрируют эти фрагменты при электрофорезе, связано с их размерами
нелинейно, чем могут объясняться различия между вашими оценками и
оценками, представленными на рис. 5-60.)
5-52 На рис. 5-61 показаны два участка полученного вашим коллегой
белка, характеризующиеся наименьшей многозначностью, и соответствующие
этим участкам олигонуклеотидные зонды. Кодоны приведены под
последовательностью аминокислот в форме РНК, чтобы легче было перейти к
генетическому коду. Олигонуклеотиды показаны в виде последовательностей
ДНК, т. е. в том виде, в каком они будут синтезированы. (Комплементарные
им последовательности тоже могут служить хорошими зондами.)
Синтез олигонуклеотидов производят путем последовательного
присоединения нуклеотидов, так что за один тщательно контролируемый цикл
химических реакций присоединяется один нуклео-
310 Г лава 5
ООООАО
5 10 15 20
25 30
MFYWMIGRSTEDWMPLYMKDFWAKHSLICE
AOGOOCOACOGGAOGAOAGGAAGAAGCACAGAAGACOGGAOGCCAOUAOACAUGAAAGACOOCOGGGCAAAAC
ACAGCUUAAUAOGCGAA
CCCOOGOAU AAGGAUUOU GCCAAGCAOAGUUUGAOCOGOGAG CCGCOA
GCG OCACOAAOU
GCO ОСССОС
OCGCOG ОСОСОО
TACATGAAAGACTTCTGGGC Т G Т Т
AOCGGCAGGAGUACCGAGGAU
AOOGGGCGAUCAACG GGUCGCOCCACUCOC CGGOCGCOG CGGUCUCOU
ATGTTCTACTGGATGATAGG Т Т С
Т
Рис. 5-61. Два олигонуклеотида, которые могли бы служить зондами для
гена, выделенного вашим другом, показаны под соответствующими участками
последовательности мРНК, определенной путем "обратной трансляции" (ответ
5-52).
5'TAGAGACCCGAAGGGCGGCG 3'
GAATCTCTGGGC TCCCGCCGCAGTAG \ /
