Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
точно посередине, в результате чего образуются рестрикционные фрагменты с
"липкими" или "тупыми" концами.)
Б. Правильно.
В. Правильно.
Г. Неправильно. Из-за присутствия интронов в геномных клонах по ним
почти невозможно определить аминокислотную последовательность кодируемых
белков. Поскольку при синтезе мРНК интроны удаляются, аминокислотную
последовательность можно установить с помощью клонов кДНК.
Д. Неправильно. Антитела должно быть направлены против белка,
кодируемого данной мРНК.
Е. Правильно.
Ж. Неправильно. Эукариотический геномный клон, вероятно, содержит
интроны, которые будут мешать правильной экспрессии белка в клетках
бактерий.
3. Неправильно. Трансгенные животные образуются за счет включения ДНК в
хромосомы клеток зародышевой линии, благодаря чему чужеродная ДНК
присутствует в последующих поколениях организма.
5-48
А. 5'- и З'-концы разрезанных молекул показаны на рис. 5-58.
Последовательности ДНК обычно представляют таким образом, что 5'-конец
верхней цепи находится слева.
Б. Как показано на рис. 5-58, концы, образующиеся при обработке BamHI,
могут быть достроены ДНК-полимеразой, а концы, образующиеся при обработке
PstI, - нет. Это различие объясняется известным свойством ДНК-полимеразы:
для ее работы необходимы праймер с З'-ОН-концом, к которому могут
присоединяться дезоксинуклеозидтрифосфаты, и матричная цепь,
определяющая, какой нуклеотид должен присоединиться. Эти требования
выпол-
5- 13" 5' 1 3'
- G G А Т С С -- - С Т G С a'G -
- С С Т A G G - - G А С G Т С -
3' ¦ 5' 3 • т 5'
| BamHI | PstI
5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3'
- G GATCC - - CTGCA G -
- CCTAG G - - G ACGTC -
3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5'
| ДНК-полимераза J ДНК-полимераза
Рис. 5-58. Расщепление, модификация и сшивание ДНК, содержащей ВатШ-сайт
или PstI-сайт (ответ
5-48).
- GGATC GATCC -
- CCTAG CTAGG -
(ДНК-лигаза фага Т4
Clal
- GGATCGATCC -
- С С Т A G С.Т A G G -
I____!_I
Tagl
- CTGCA G -
- G ACGTC -
ДНК-лигаза фага T4
PstI
- С I G С A G --
- G|AC G T С -
20*
няются в случае BamHI-концов, но не в случае концов, образуемых
рестриктазой PstI, которая разрезает дальше от 5'-конца, в результате
чего фрагменты не достраиваются ДНК-полимеразой, так как 5'-конец не
может служить затравкой.
Примечание: обычно в методе рекомбинантной ДНК используется ДНК-
полимераза фага Т4, чтобы "затупить" концы обоих типов. Концы BamHI будут
"затупляться" в результате пришивания к ним соответствующих нуклеотидов,
как показано на рис.
5-58. Однако PstI-концы также будут затупляться благодаря
ассоциированной 3' -* 5'-экзонуклеазной активности, которая удаляет
участок у З'-конца, оставляя тупой конец.
В. Как видно на рис. 5-58, затупленные концы в случае BamHI и
немодифицированные концы в случае PstI могут соединяться ДНК-лигазой фага
Т4.
Г. Соединение обработанных концов приводит к восстановлению PstI-
сайта, но не ВатН1-сайта. За счет соединения достроенных концов в случае
BamHI образуются два новых рестрикционных сайта, как указано на рис. 5-
58. Расщепление, достраивание на концах и соединение концов заново часто
приводят к появлению новых рестрикционных сайтов, которые иногда полезны
для дальнейших манипуляций с ДНК.
5-49
A. Четыре центральных нуклеотида в сайте, узнаваемом BamHI, образуют
сайт, узнаваемый Sau3A. Поскольку Sau3A узнает только эти четыре
нуклеотида, все ВатН1-сайты будут разрезаться ферментом Sau3A. Обратного,
однако, не может быть, потому что BamHI узнает сайт, состоящий из шести
нуклеотидов. Таким образом, BamHI будет разрезать только часть сайтов,
узнаваемых Sau3A, у которых есть соответствующие соседние нуклеотиды (т.
е. 5'G и З'С). Поскольку в среднем один из четырех соседних нуклеотидов
на каждой стороне окажется правильным, то лишь одно из 16 возможных
расположений двух пограничных нуклеотидов будет подходящим для того,
чтобы сайт расщеплялся BamHI. Таким образом, только 1 из 16 сайтов,
узнаваемых Sau3A, будет разрезаться BamHI.
Б. Поскольку для Sau3A, как уже было отмечено, не имеют значения
пограничные нуклеотиды, все гибридные сайты Sau3A/BamHI могут разрезаться
с помощью Sau3A. Однако с помощью BamHI будет разрезаться в среднем
только один из четырех гибридных сайтов. В гибридном сайте пять из шести
нуклеотидов будут соответствовать ВатШ-сайту; шестой нуклеотид окажется
правильным примерно в одном из четырех гибридных сайтов.
B. Вероятность того, что любая четырехнуклеотидная последовательность
окажется 8аиЗА-сайтом, равна (1/4)4, или 1 из 256, в выбранной случайным
образом последовательности ДНК, где все четыре нуклеотида встречаются с
