Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
* (С) на С-конце указывает на связь с белком-носителем через цистеин.
Таблица 14-4. Тестирование фибронектин-подобных пептидов на способность
блокировать прикрепление клеток (задача 14-14)
Пептид Процент прикрепившихся клеток
GRGDSPC 2,0
GRGDAPC 1,9
GKGDSPC 48
GRADSPC 49
GRGESPC 44
Отсутствует 47
Рис. 14-12. Анализ ДНК зародышей, полученных от скрещивания "брат х
сестра" (задача 14-15).
А. Соотношение между нормальным геном и геном с ретровирусной вставкой.
Б. Радиоавтограф, полученный после расщепления ДНК рестриктазой (R),
которая не действует на ретровирус, и последующего разделения фрагментов
в геле. ДНК переносили на нитро-целлюлозный фильтр, гибридизова-ли с
радиоактивным зондом, который соответствовал клеточным
последовательностям, расположенным непосредственно вблизи сайта
встраивания, и подвергали радиоавтографии.
Б. По результатам, приведенным в таблицах, определите, какая
аминокислотная последовательность фибронектина узнается клетками.
В. Как можно использовать эти результаты для создания метода
выделения рецептора фибронектина?
14-15 Один из способов получения мутаций у мышей состоит в том, что
зародышей инфицируют ретровирусами, которые встраиваются в геном
случайным образом. Если ретровирус включается в клетку, которая станет
частью зародышевой линии, то он сохраняется в последующих поколениях.
Используя этот метод, вы получили чрезвычайно интересную линию, в которой
ретровирус, по-видимому, встроился в ген, имеющий решающее значение для
раннего эмбрионального развития (рис. 14-12, А). Важная роль этого гена
выявляется в опытах по скрещиванию брат х сестра между гетерозиготами по
ретровирусной вставке с последующим анализом ДНК от 12-дневных зародышей.
Используя зонд, расположенный непосредственно около сайта встраивания, вы
обнаруживаете три явно различающихся набора фрагментов гибридизации (рис.
14-12, Б): набор 1 характерен для гомозигот
А. СТРУКТУРА ГЕНОВ Б¦ АНАЛИЗ В ГЕЛЕ
Нормальный Мутантные зародыш зародыши
1 2 3
Мутант
,W\\\4\\W4\
t
R
Ретровирус
Зонд
X\\\\\\\\\\\\NNSS\
t R
Зонд
Дикий ТИП
t Д t
R / \ R
272 Глава 14
Исследуемый ген Гены коллагена
"1(0 "2(1) РНК км км
км
6,5
5,2
Рис. 14-13. Анализ мРНК контрольных (к) и мутантных (м) зародышей (задача
14-15). РНК выделена из нормальных и мутантных гомозиготных зародышей,
разделена в геле и подвергнута гибридизации с радиоактивно меченной ДНК
исследуемого гена и клонов гена коллагена. Числа указывают размеры мРНК в
т. п. н. На нескольких дорожках видны две полосы гибридизованной РНК; для
некоторых генов эукариотических клеток характерно образование
множественных форм мРНК.
по нормальному гену, набор 2-для гетерозигот, а набор 3-для гомозигот
по мутантному гену.
Набор 3 выявляется примерно у четвертой части 12-дневных зародышей,
но вы никогда не находите его у новорожденных. Выясняется также, что
примерно на 14-й день такие зародыши погибают, по-видимому, из-за
обильного кровотечения из крупных кровеносных сосудов. Во всех остальных
отношениях основные ткани и типы клеток кажутся нормальными. Из этого
следует, что у гомозигот мутантный ген вызывает нарушение на определенной
стадии развития.
При последующей работе вы обнаруживаете, что мРНК, соответствующая
поврежденному гену, вырабатывается только фибробластами, миобластами и
хондроцитами. Кроме того, вы устанавливаете, что эта мРНК появляется в
заметных количествах на 12-й день и затем ее уровень существенно
повышается по мере развития. Все эти факты-уровень экспрессии, типы
участвующих в этом клеток и разрыв кровеносных сосудов - заставляют вас
заподозрить, что дефектный ген кодирует коллаген или какой-то другой
компонент внеклеточного матрикса. В соответствии с этим вы берете у
других исследователей несколько клонов гена коллагена и используете их
для анализа мРНК от 12-дневных нормальных и гомозиготных мутантных
зародышей (см. рис. 14-13).
A. Какой ген оказался дефектным из-за встраивания ретровируса? Не
удивляет ли вас результат идентификации гена в связи с тем, что у
зародышей мышей явно повреждены кровеносные сосуды?
Б. Какая часть 12-дневных зародышей, полученных при скрещивании
гетерозигот брат х сестра, даст наборы 1, 2 и 3, приведенные на рис. 14-
12? Какая часть новорожденных мышей даст такие наборы?
