Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
денатурации при 45°С в условиях, при которых дисульфидные связи
оставались интактными. Затем температуру снижали до 25°С, создавая
условия для восстановления коллагенов, и периодически отбирали пробы в
течение 60 мин. Каждую пробу сразу же обрабатывали трипсином, который
быстро расщепляет денатурированные цепи, но не затрагивает цепи в
спиральной молекуле коллагена. Затем пробы исследовали с помощью
двумерного электрофореза в присутствии 2-меркаптоэтанола, который
разрушает дисульфидные связи. Оба коллагена дали одинаковые полосы в геле
(рис. 14-11). Обращает на себя внимание то,
Время экспозиции при 25° С ,мин 5 10 20 30 40 50 60
Маркер
нативного
коллагена
270 Глава 14
что, если дисульфидные связи оставались интактными во время
электрофореза, все полосы сменялись полосами с трехкратно увеличенной
мол. массой.
A. Почему все устойчивые к трипсину пептиды увеличиваются в три раза
по мол. массе, если дисульфидные связи остаются интактными?
Б. Какие дисульфидные связи в pN-коллагене типа III (N-концевые или
С-концевые) ответственны за увеличение мол. массы этих устойчивых
пептидов?
B. Как начинается сборка таких коллагеновых молекул: по специфическим
или по случайным участкам? Если по специфическим, то укажите эти участки.
Г. Происходит ли сборка с помощью механизма типа застежки-молнии или
в ее основе лежит принцип "все или ничего"? Как это определить на основе
приведенных результатов?
14-14 Фибронектин-это крупный гликопротеиновый компонент внеклеточного
матрикса. В его молекуле имеется несколько связывающих доменов,
расположенных вдоль полипептидной цепи; один из них служит для
присоединения к рецепторам фибронек-тина на клеточной поверхности.
Фибронектин способен прикреплять клетки к поверхностям, на
которых другим способом они не могли бы закрепиться. На этом основан
простой способ изучения той части его молекулы, которую узнает рецептор
фибронектина. Фибронектин наносят на поверхность пластиковых чашек. Затем
в них помещают суспензию клеток и проводят инкубацию в течение 30 мин,
после чего чашки отмывают и подсчитывают число прикрепившихся клеток. В
отсутствие фибронектина клетки не прикрепляются, а в его присутствии
прикрепляется 80-90% клеток. Другие белки, например сывороточный
альбумин, прикрепляются к пластику, но не способствуют прикреплению
клеток.
С помощью такого метода можно анализировать очень мелкие
фрагменты фибронектина при условии, что они химически соединены с
крупными молекулами, например с альбумином, обеспечивающими прикрепление
к пластиковым чашкам. Получая фрагменты фибронектина, можно
идентифицировать домен, связывающийся с клеткой, например сегмент из 108
аминокислотных остатков, составляющий три четверти длины всей цепи от N-
конца.
Для точной локализации активного участка с помощью метода
связывания клеток были проверены синтетические пептиды, соответствующие
различным участкам сегмента из 108 аминокислотных остатков. Были
поставлены эксперименты двух типов. В одних пептиды ковалентно
связывались через цистеиновый остаток с белком, покрывающим пластик,
после чего их проверяли на способность вызывать прикрепление клеток.
Полученные результаты представлены в табл. 14-3. В других опытах
пластиковые чашки покрывали нативным фибронектином и клетки инкубировали
в чашках в течение 30 мин в присутствии синтетических пептидов, указанных
в табл. 14-4. Затем чашки отмывали и подсчитывали число прикрепившихся
клеток.
А. В экспериментах двух типов использованы разные подходы к
определению присоединяющегося к клеткам фрагмента фибронектина. Одинаковы
ли способы прикрепления клеток к чашке в двух вариантах опытов? Объясните
разницу между вариантами.
Клеточная адгезия, контакты, матрикс 271
Таблица 14-3. Тестирование фибронектин-подобных пептидов на способность
вызывать прикрепление клеток (задача 14-14)
Пептид Последовательность Концентрация,
необходимая для
прикрепления 50%
клеток, нмоль/мл
Фибронектин 0,10
Пептид 1 YAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSQM(C)* 0,25
Пептид 2 VTGRGDSP ASS К.Р 1(C) 1,6
Пептид 3 SINYRTEIDKPSQM(C) > 100
Пептид 4 VTGRGDSP А(С) 2,5
Пептид 5 SPASSKPIS(C) > 100
Пептид 6 VTGRGD(C) 10
Пептид 7 GRGDS(C) 3,0
Пептид 8 RGDSPA(C) 6,0
Пептид 9 RVDSPA(C) > 100
