Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
глюкокортикоиды. Чтобы картировать эти чувствительные к глюко-кортикоидам
элементы в составе LTR, вы произвели серию делеций, в результате которых
были удалены различные по длине фрагменты LTR (рис. 12-4), и затем
определили связывание полученных сегментов ДНК с глюкокортикоидными
рецепторами. Для измерения связывания вы разрезали каждую мутантную ДНК
на фрагменты, провели очистку фрагментов, содержащих последовательности
LTR, и пометили их концы радиоактивным фосфором 32Р. Затем вы
проинкубировал смесь меченых фрагментов с очищенным глюкокортикоидньш
рецептором. Инкубационную смесь вы пропустили через нитро-целлюлозный
фильтр, на котором белок (а вместе с ним и связанная ДНК) адсорбируется,
а свободная ДНК-нет. Связавшиеся с рецептором фрагменты ДНК вы выявили с
помощью электрофореза в агарозном геле. Электрофоретическая картина
исходной смеси сегментов и сегментов, связанных с рецептором, показана на
рис. 12-4.
ГИБРИДНЫЕ ДНК
Данные электрофореза
-400 _____I__
Рве. 12-4. Схема делеций в LTR и данные электрофореза для смеси исходных
фрагментов ДНК и смеси фрагментов, которые связались с фильтрами (задача
12-11). Нуклеотиды пронумерованы относительно начальной точки
транскрипции (+ 1); отрицательные номера расположены перед ней,
положительные-после. В качестве картины электрофореза представлен
радиоавтограф агарозного геля.
Транскрипция I----------->
-300 -200 -t00
-I______________I____________I___
+100
-LTR-
Исходные Фрагменты, фрагменты адсорбированные на фильтре
Размер
550
-240
340
302
237
150
50
Межклеточная сигнализация 221
Рис. 12-5. Последовательности 1.
ДНК, которые связываются с 2 .
рецептором глюкокортикоидов 3.
(задача 12-11). 4.
5.
6.
7 . 8.
9.
10. 11.
CCAAGGAGGGGACAGTGGCTGGACTAATAG
GGACTAATAGAACATTATTCTCCAAAAACT
TCGTTTTAAGAACAGTTTGTAACCAAAAAC
AGGATGTGAGACAAGTGGTTTCCTGACTTG
AGGAAAATAGAACACTCAGAGCTCAGATCA
CAGAGCTCAGATCAGAACCTTTGATACCAA
CATGATTCAGCACAAAAAGAGCGTGTGCCA
CTGTTATTAGGACATCGTCCTTTCCAGGAC
CCTAGTGTAGATCAGTCAGATCAGATTAAA
GATCAGTCAGATCAGATTAAAAGCAAAAAG
TTCCAAATAGATCCTTTTTGCTTTTAATCT
А. НОРМА
Добавление
экдизона
Б. ЦИКЛОГЕКСИМИД
Добавление экдизона и циклогексимида
В, ЭКДИЗОН
(пульсовая обработка)
\
8ремя, ч
Добавление экдизона
Удаление
экдизона
Рк. 12-6. Динамика образования "уфов в хромосомах слюнных влез (задача
12-12). А. В норме.
I. В присутствии циклогексимида.
В. После удаления экдизона.
А. В каком месте LTR расположены чувствительные к глюкокор-тикоидам
элементы?
Б. На рисунке 12-5 приведены одиннадцать последовательностей MMTV
(некоторые из них входят в состав LTR), связывающихся с рецептором
глюкокортикоидов. Можете ли вы найти в них обобщенную последовательность
(консенсус-последовательность), с которой связывается рецептор?
12-12 Личинки дрозофил линяют в ответ на повышение концентрации
стероидного гормона экдизона. Замечательной экспериментальной системой
для изучения гормон-индуцируемой активности генов служат политенные
хромосомы слюнных желез дрозофилы, потому что их активные гены
увеличиваются в размерах, образуя пуфы, которые видны в световой
микроскоп, причем величина пуфа пропорциональна скорости его
транскрипции. Некоторые пуфы, называемые межлинечными, активны и без
добавки экдизона. Если же к выделенным слюнным железам добавить экдизон,
то эти межлинечные пуфы исчезают, зато возникают две группы новых пуфов.
Первая группа (ранние пуфы) появляется уже спустя несколько минут после
добавления экдизона, тогда как вторая (поздние пуфы)-лишь по прошествии
4-10 ч. Следует отметить, что концентрация экдизона на протяжении всего
этого периода времени остается неизменной. Динамика появления и
исчезновения пуфов после добавки экдизона схематично изображена на рис.
12-6, А.
Два решающих эксперимента помогают прояснить взаимоотношения
между пуфами различных классов. В первом опыте одновременно с экдизоном
добавляют циклогексимид, блокирующий синтез белка. Как показано на рис.
12-6, Б, в этих условиях ранние пуфы не исчезают, а поздние не
появляются. Во втором эксперименте проводится инкубация с экдизоном в
течение 2 ч, после чего препарат хромосом отмывают от него. Из рис. 12-6,
В видно, что такая обработка вызывает немедленную регрессию ранних пуфов
и преждевременную индукцию поздних пуфов.
A. Как вы думаете, почему в присутствии циклогексимида ранние пуфы
не регрессируют, а поздние не индуцируются? Почему ингибитор не влияет на
