Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
представить себе, и должно выглядеть это скольжение в цилиндрическом пущ
периферических дублетов аксонемы. Ручки динеина располоя* ны таким
образом, что при активации они толкают соседни
/
Oci
ак
Н
м
Рис.
в по. А. И: рузю
Тов, 180) дуб/ на 3
хул
Цитоскелет 205
дублет
. 11-15. Жгутик, изогнувшийся лукольцо (задача 11-18). зображение
"внутреннего" и "на-ого" периферических дубле-, отстоящих друг от друга
на нм. Б. Изображение соседних етов, отстоящих друг от друга 30 нм, и
соединяющих их моле-нексина.
дублет в направлении конца реснички. В цилиндрическом пучке, если
все динеиновые ручки будут одинаково активны, никакое движение произойти
не сможет (эта ситуация напоминает вставших в кружок силачей, каждый из
которых пытается оторвать своего соседа от земли; если бы им всем это
удалось, они бы взлетели).
Предложите такое распределение активности динеина
(согласующееся со строением аксонемы и направленностью работы ручек), при
котором аксонема могла бы изгибаться в одном направлении. Как должно
измениться это распределение, чтобы произошел изгиб в противоположном
направлении?
11-20 Аксонема реснички, состоящая более чем из двухсот различных белков,
устроена чрезвычайно сложно. Структуру аксонемы очень удобно изучать на
одноклеточной водоросли Chlamydo-monas reinhardtii, клетки которой несут
по два жгутика. На ней легко проводить физиологические и микроскопические
наблюдения, и что еще более важно, на ней легко проводить генетический и
биохимический анализ. В частности, очень просто выделить мутантов с
парализованными жгутиками, благодаря тому, что они неподвижны. С помощью
методов скрещивания можно идентифицировать гены, в которых произошли
мутации. Наконец, жгутики у клеток дикого типа и мутантов легко
отделяются (например, в результате pH-шока) и их можно получить в виде
высокоочшценных препаратов, чтобы исследовать биохимическими методами.
Мутанты с парализованными жгутиками обычно лишены тех или иных
существенных компонентов аксонемы, таких как радиальные спицы, наружные
динеиновые ручки, внутренние динеиновые ручки, одна или обе центральные
микротрубочки. В большинстве случаев потеря элементов структуры аксонемы
вызвана мутацией, затрагивающей только один ген, но тем не менее при
биохимическом анализе обнаруживается, что в дефектной аксонеме недостает
многих белков. Рассмотрим, например, мутант pf 14 (от paralyzed
/lagella): электронные фотомикрографии показывают, что он полностью лишен
радиальных спиц (рис. 11-16, А), а при анализе белков жгутика с помощью
двумерного электрофореза выявляется отсутствие 17 различных белков (рис.
11-16, Б).
Исчезновение многих белков в результате дефекта в одном гене
можно объяснить двумя путями: 1) дефект присутствует в регуляторном гене,
который контролирует синтез исчезнувших белков; 2) дефект содержится в
гене, продукт которого в норме должен присутствовать в структуре до того,
как в нее включатся другие белки. Для проверки этих возможностей было
использовано два подхода.
А. Первый подход основан на особенности цикла спаривания у
Chlamydomonas. В ходе спаривания происходит слияние двужгутиковых гамет,
и временно образуется популяция дикарио-нов, несущих четыре жгутика. При
спаривании гамет pf\ 4 с гаметами дикого типа парализованные жгутики
после слияния начинают функционировать, что указывает на возможность
восстановления дефектных структур и без их полной перестройки. (В
нормальных клетках есть запас компонентов, достаточный для построения
нового целого жгутика даже в отсутствие синтеза белка.) Чтобы выяснить,
какой из возможных дефектов жгутиков имеет место, исследователи пометили
мутантные
206 Глава 11
Рис. 11-16. Сопоставление жгутиков из Chlamydomonas дикого типа и из
мутанта pfl4 (задача 11-20).
А. Электронные фотомикрографии поперечных и продольных срезов жгутиков.
Обратите внимание на отсутствие радиальных спиц у мутанта pfl4. Б. Анализ
жгутиков с помощью двумерного электрофореза. Первое направление
(горизонтальное)-разделение по изо-электрической точке (изоэлектри-ческое
фокусирование), более кислые белки расположены справа; второе направление
- разделение по мол. массе (электрофорез в полиакриламидном геле в
присутствии додецилсульфата натрия). Стрелки указывают положение белков,
которые есть в жгутиках клеток дикого типа, но отсутствуют в жгутиках
мутанта pfl4. Сильно экспонированные области соответствуют а- и (5-
тубулинам, количество которых в аксонеме несравнимо больше количества
всех прочих белков. (По G. Pipemo, В. Huang, Z. Ramanis, and D. Luck, J.
Cell Biol. 88: 73-79, 1981. Перепечатано с разрешения Rockefeller
University Press.)
ДИКИЙ тип
МУТАНТ pf 14
клетки изотопом 35S04, добавив его в среду для роста, и затем
индуцировали слияние меченых гамет мутанта с немеченым гаметами дикого
типа (в присутствии ингибиторов белкового синтеза). Жгутики после
восстановления их функции выдели, и радиоактивные белки проанализировали
