Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
бром-цнана (100 мг/мл). Раствор в течение 10 мин (включая время,
необходимое для прибавления бромциана) осторожно перемешивают при 5-10
°С. Продукт активации промывают на стеклянном фильтре холодной водой до
нейтральной реакции.
Метод Б. Высокоактивированные гели агарозы (р=4-8%)
Гель агарозы промывают 2 М фосфатным буфером и отфильтровывают при
отсасывании. 10 г р %-ной агарозы суспендируют в 2,5 р мл холодного
фосфатного буфера и активируют, как в методе А, с 1,0 р мл водного
раствора бромциана.
Метод В. Среднеактивированные гели агарозы (р - 1-8%)
Методика идентична описанной для метода А; для приготовления суспензии
используют 0,5 р мл буферного раствора и прибавляют 0,2 р мл бромциана.
Метод Г. Слабоактивированные гели агарозы (р=1-8%)
Методика аналогична описанной для метода А; для приготовления суспензии
используют 0,12 р мл буферного раствора и прибавляют 0,05 мл бромциана.
Активированные продукты быстро промывают 0,25 М карбонатом натрия (pH 9),
в котором проводили связывание химотрипсина, по методике, подобной той,
которая используется для промывания продажной активированной се-фарозы.
192
Глава 8
Упрощенный метод активации агарозы бромцианом [44, 45]
Бромциан растворяют в ацетонитриле (2 г/мл, т. е. 19 моль/л). Раствор
устойчив при -20 "С и может храниться при этой температуре.
Равные объемы
50%-ной (по объему) водной суспензии агарозы и растворы 2 М
карбоната
натрия смешивают и охлаждают во льду. Затем прибавляют ацетонитрильный
раствор бромциана (0,2 г бромциана на 1 мл набухшей агарозы) и смесь 1-2
мин перемешивают. Активированный гель затем промывают и добавляют к
раствору связываемого вещества (например, в 0,2 М бикарбонате
натрия,
pH 9,5). Преимуществом этого метода является его простота и
существенное
сокращение неприятных и опасных манипуляций с бромцианом во время взве-
Высокая стабильность бромциана в Ы-метил-2-пир-ролидоне использована Ни-
шикавой и Бэйлоном [49] при изучении влияния количества бромциана на
активацию агарозы. На рис. 8.2 показано влияние бромциана на связывание
6-аминогексановой кислоты 6, 4 и 2%-ной агарозой. Бромциан прибавлялся в
виде 16%-ного (по объему) 'водного раствора в N-ме-тил-2-пирролидоне.
Конечное количество связанного аффинного лиганда можно регулировать,
изменяя количество бромциана, вводимого при активации. Необходимо, чтобы
используемые препараты бромциана были бесцветными, а кристаллы
практически не плавились. Желтоватоокрашенные препараты плохо реагируют.
Изучение влияния концентрации е-аминокапроновой кислоты на ее связывание
активированной бромцианом сефарозой показало, что высокая концентрация
аффинного лиганда при коротком времени инкубации дает лучшие результаты,
чем низкая концентрация при продолжительной инкубации.
В табл. 8.4 приведены количества аффинного лиганда, связанного с 2, 4 и
6%-ной агарозой, а также рассчитанные значения ожидаемой плотности
гидроксильных групп в различных гелях агарозы. Выход в реакции
химического присоединения для
Рис. 8.2. Влияние бромциана на присоеди-' иение е-аминокапроновой кислоты
[49].
6%-ная агароза (сефароза 6В) (Л" 4%'Ная агароза (сефароза 4В) \2) и
2%-ная агароза (бногель
А-50гп) (3) при 4-10*0 обрабатывались бромциа' ном. Для присоединения
использовали сравнимые количества е-аминокапроновой кислоты (0,018 моль
на 100 мл активированного геля). Карбоксильные группы в геле определяли
титрованием.
Со
I
01
Таблица 8.4
Свойства гелей агарозы
Гель Содер- жание агарозы, % Рассчитанные значения плотности
гидроксильных групп, ноль/л [4SJ Молеку- лярная масса (ХЮ<>> исключения
149] Предельное химическое связывание (присоединение 1,6-Диамкно-
гексана). мкэкв./мл [49] Содержание эластазы в реакционной смеси, мг
на 1500 мг сухого геля [701 Содержание эластазы срязэнной, мг на 1 г
сухого конъюгата [70] Выход фермента (относительно исходного количества
фермента), % [70J Максимальная скорость потока до и после
присоединения п-амннофенил-p-D-тн огал актоп нранозид а, мл >мин- 1*см-2
[61]
до после
Сефароза 2В 2 50 12,5 37,5 0,95 1,1
Биогель А-50т 2 0,29 50 5 - - - - -
Сефароза 4В 4 0,58 15 20 50 25 80 1,8 2,2
Сефароза 6В 6 0,88 5 ' 60 50 33 99 3,6 3,8
194
Глава 8
всех типов гелей составляет, по-видимому, около 1-2% от числа
гидроксильных групп, которые могли бы участвовать в реакции, В табл. 8.4
приведены также данные, полученные Санбергом и Кристиансеном [70] для
связывания эластазы активированными бромцианом сефарозами 2В, 4В и 6В и
определенные Робинсоном и др. [61] максимальные скорости потока через
колонка с индивидуальными типами сефарозы до и после присоединения гс-
ами-нофенил-р- d -тиогалактопиранозида.
Из работы Нишикавы и Бэйлона [49] следует важный вывод, касающийся этого
метода и заключающийся в необходимости поддержания температуры между 4 и
10°С во время реакции активации бромцианом, в то время как реакция
связывания аффинного лиганда может проводиться при комнатной температуре.
