Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
добавляемого бромциана 2 М NaOH, а для 100-300 мл набухшей сефарозы и 20-
30 г бромциана - 8 М NaOH. Температура не должна превышать 20 (r)С, если
необходимо охлаждение, добавляют лед. Реакция заканчивается за 8-12 мин,
После быстрого перенесения суспензии в вороику Бюхнера при постоянном
отсасывании активированную сефарозу промывают охлажденным буферным
раствором того же состава, который используется при последующей привязке
аффинного лиганда. Объем буферного раствора для промывания должен быть в
10-15 раз больше объема раствора, в котором проводилась активация
сефарозы. Промытая сефароза как можно быстрее суспендируется в равном
объеме раствора аффинного лиганда. Согласно Куатреказасу [12], промывка,
добавление раствора аффинного лигаида и смешивание не должны занимать
более 90 с. Даже при низкой температуре активированная сефароза
нестабильна.
Активированная бромцианом сефароза 4В поступает в продажу в виде
лиофильно высушенного продукта, содержащего дек-стран и лактозу, которые
перед использованием следует отмывать. Ниже приводится методика для
привязки аффинного лиганда к активированной бромцианом сефарозе,
предлагаемая фирмой Pharmacia.
Требуемое количество геля замачивают для набухания в 10-3 М соляной
кислоте; 10-3 М соляную кислоту используют также для промывки геля в
течение 15 мин. 1 г лиофильно высушенного геля набухает до объема -'3,5
мл. Гель рекомендуется промывать в несколько приемов, используя на 1 г
сухого геля 200 мл раствора. Сразу же после промывки добавляют раствор
аффинного лиганда, который необходимо привязать к сефарозе. Оптимальные
условия для связывания аффинного лиганда (pH, состав буфера и
температура) зависят до определенной степени от характера лиганда. Как
правило, реакция связывания наиболее эффективна при pH 8-10, но можно
использовать и более низкие значения pH, если этого требует природа
связываемого лиганда. Аффинный лиганд присоединяется в достаточных
количествах даже и при этих pH, если увеличить количество бромциана при
активации и количество лиганда при связывании, Аффинный лиганд, в
особенности белкового характера, растворяют в буфере с высокой ионной
силой (около 0,5) для предотвращения неспецифической адсорбции. Высокая
ионная сила облегчает затем последующую промывку. Можно использовать
карбонатный и боратиый буферы с добавками хлорида натрия.
Количество связанного аффинного лиганда зависит от содержания его в
реакционной смеси и объема геля, pH реакции, природы присоединяемого
лиганда (числа реакционных групп и т. п.), а также от времени реакции и
температуры. Например, при присоединении химотрипсина к 2 мл
активированной бромцианом сефарозы при pH 8 из 10 мг присутствующего
белка присоединяется только 5 мг, из 20 мг 8 мг, а из 30 мг 10 мг. При
комнатной температуре (20-25 °С) присоединение обычно заканчивается за 2
ч, в то время как при более низких температурах рекомендуется оставлять
реакционную смесь на ночь. Реакционную смесь следует перемешивать, однако
не рекомендуется использовать магнитную мешалку, так как это может
привести к механической деструкции геля.
Когда присоединение заканчивается, гель с привязанным аффинным лигандом
переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают тем же самым буферным
раствором, в котором проводилось присоединение. Для удаления оставшихся
активных групп фирма Pharmacia рекомендует блокировать их обработкой 1 М
2-аминоэтанолом при pH 8 в течение 2 ч. Продукт должен быть затем
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
191
промыт 4-5 раз другими буферными растворами с высоким и низким pH
[например, ацетатным (0,1 моль/л, pH 4) и боратным (0,1 моль/л, pH 8,5)
буферами, содержащими 1 моль/л хлорида натрия]. Как уже указывалось, все
вещества, связанные не ковалентно, должны быть удалены в ходе промывок.
Активация агарозы бромцианом в концентрированном фосфатном буфере [54]
Для активации больших количеств агарозы и для активации мембран из
агарозы или тонких слоев агарозы, покрывающих стеклянные шарики, Порат и
др. [54] разработали очень простой и воспроизводимый метод активации в
щелочном фосфатном растворе очень высокой буферной емкости; при этом
отпадает необходимость контроля pH и интенсивного перемешивания. Найдены
условия для высокой, средней и низкой степеней активации, которые
выбираются, исходя из природы связываемого аффинного лиганда. Кроме того
для высокой степени активирования гелей, были выбраны условия как для
гелей с низким содержанием агарозы (р= 1-4%), так и с высоким {/> = 4-8%)
содержанием. Методики даны для гелей с разным содержанием (р, %) агарозы
в набухшем геле.
Метод А. Высокоактивированные гели агарозы (р-1-4%)
Набухший гель (10 г р %-ной агарозы) суспендируют в 2,5 р мл холодного
(5-10 °С) 5 М К-фосфатного буфера (3,33 моль K>POt +1,67 моль К2НРО4 в 1
л раствора). Суспензию разбавляют дистиллированной водой до 20 мл и
прибавляют небольшими порциями в течение 2 мин 0,1 р мл водного раствора
