Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
эгиленгликоле. Лиофильное высушивание можно осуществлять только после
добавления в водную суспензию сорбента защитных веществ, например
декстра-на, глюкозы и сывороточного альбумина.
Стабильность матрицы агарозы можно значительно повысить путем сшивания
эпихлоргидрином [34, 56], 2,3-дибромпропанолом [34, 36] или
дивинилсульфоном [34, 58] перед активацией бромцианом. Устойчивость в
водной среде как в кислой, так и в щелочной областях (pH 3-14) растет с
увеличением числа сшивок. Возможность использования хаотропных солей,
главным образом для элюирования антител, обсуждается в разд. 10.2.
Благодаря сшиванию гели приобретают большую устойчивость в органических
растворителях, таких, как спирт, диметилформамид, тетра-гидрофуран,
ацетон, диметилсульфоксид, хлороформ, хлористый метилен, дихлорэтан и
дихлорэтан - пиридин (1 : 1).
Связывание аффинных лигандов с агарозой, активированной бромцианом
Наиболее широко используемый метод связывания аффинного лиганда с
сефарозой разработан Поратом, Аксеном и Эрнбаком [2,55]; он основан на
активации носителя бромцианом. Аффинные лиганды связываются посредством
первичных алифатических или ароматических аминогрупп в непротонированной
форме. Ак-сен и Эрнбак [1] предположили, что при этом образуются три
различные структуры, а именно N-замещенные карбаматы, N-за-мещенные
имидокарбонаты и N-замещенные изомочевины. N-за-мещенная мочевина, как
предположил Свенсон [72] на основании работ по изоэлектрофокусированию,
является преобладающей формой. Вильчек и др. [93] представили различные
химические доказательства того, что N-замещенные изомочевины
действительно являются главными продуктами реакции между аминами и
сефарозой, активированной бромцианом, как это показано на следующей
схеме:
Активация Присоединение
Присоединение аминов к сефарозе, активированной бромциа-ном, приводит,
таким образом, к замещенным изомочевинам. Так,
Сефароза
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
189
б результате реакции в нейтральной.и щелочной средах образуются группы,
способные протонироваться и функционирующие-как ионообменники. Дальнейшее
добавление аминов к N-заме-щенным изомочевинам приводит к образованию Мь
Ыг-дизаме-щенных гуанидинов. В комбинации с гидрофобными цепами ал-
киламинов образующиеся положительные заряды действуют как детергенты. В
результате этого возрастает неспецифическая сорбция, что может
рассматриваться как обратимая денатурация белков "детергеноподобными"
производным^ агарозы и как следствие в некоторых случаях, например при
элюировании пеницилли-назы с этилсефарозы 1 М раствором хлорида натрия,
происходит инактивация фермента [90].
Образование катионных групп носителя на стадии Б может быть предотвращено
использованием гидразидов вместо алифатических аминов. Образующиеся
производные имеют р/С 4,2, и, следовательно, они не заряжены при
нейтральных pH [37, 50, 91, 92]. Преимущества использования в качестве
пространственных групп гидразидов детально обсуждаются в разд. 8.3.
Изучение реакции N-замещенной изомочевины, конъюгированной сефарозой, с
аминами и бычьим сывороточным альбумином [93] помогло понять расхождение
между опубликованными дам-ными о стабильности конъюгатов. Соединения,
содержащие нуклеофилы, например амины или белки, расщепляют связи
изомочевины согласно приведенной выше схеме. Если расщепление связей
наблюдается в отсутствие таких соединений, то это происходит, вероятнее
всего, благодаря освобождению адсорбированных молекул аффинного лиганда,
которые были плохо отмыты. Количество освобождающегося лиганда в
результате очень медленного гидролиза изомочевпны обычно очень мало и не
мешает нормальному процессу аффинной хроматографии. Как показано в фазд.
8.5, отщепление аффинного лиганда от специфического сорбента существенно
главным образом в системах с высоким сродством или при выделении
небольших количеств вещества. Шнапп и Шалитин [65] предотвращали
отщепление аффинных лигандов под действием нуклеофилов после
присоединения к сефарозе, активированной бромцианом, путем замены связи
изомочевины более устойчивой связью гуанидина, для чего бромцианом
активировали носитель, содержащий аминогруппы.
Степень активации агарозы, оцениваемая данными о емкости но связыванию
небольших пептидов ш, прямо пропорциональна рн. Активация проводится при
pH 11. Методика активации сефарозы бромцианом детально описана ниже [2,
12, 55].
I
(Активация агарозы бромцианом при контроле pH с помощью рН-метра
Отмытая и декантированная сефароза суспендируется в дистиллированной
воде (1 :1). Работу проводят под тягой. Электроды pH-метра погружают в
сус-Ьеизию, в которую при постоянном перемешивании прибавляют небольшими
пор-
190
Глава 8
циями бромциан (50-300 мг на 1 мл набухшей сефарозы). pH суспензии
поддерживают -'11, добавляя раствор едкого натра. Концентрацию последнего
выбирают в зависимости от количеств сефарозы и бромциана. Куатреказас
[12] рекомендует использовать для 5-10 мл набухшей сефарозы и I-3 г
