Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
2) сефароза 4В, соответствующая ~4%-ной агарозе; набухшие гранулы
размером 40-190 мкм; для фракционирования веществ с молекулярной массой
3-105-3-106; 3) сефароза 2В, соответствующая 2%-ной агарозе; размер
частиц 60-250 мкм; для фракционирования веществ с молекулярной массой 2-
10е-25-106.
Из табл. 11.1 видно, что наиболее часто используется сефароза 4В;
сравнение некоторых свойств сефароз 2В, 4В и 6В дано в табл. 8.4. В 1975
г. введена в практику сефароза CL (2В, 4В и 6В), приготовленная из
соответствующих сефароз путем поперечного сшивания 2,3-дибромпропанолом в
сильнощелочной среде с последующим обессериванием щелочным гидролизом в
восстанавливающих условиях.
Известно несколько типов биогелей А;
Все эти гели производятся с частицами трех размеров, а именно 149-290,
74-149 и 38-74 мкм. Они поставляются полностью гидратированными в
суспензии, содержащей 0,02% азида натрия, 0,001 М трис и 0,001 М ЭДТА.
Гели агарозы [5А(3(аголель)-10, 8, 6, 4 и 2] с пределами исключения
молекулярной массы 25-104-15-107 поставляются также фирмами Seravac Labs.
(Англия) и Mann Labs. (США). В качестве растворителей рекомендуются
разбавленные водные растворы солей.
Производные сефарозы, готовые для прямого присоединения аффинных
лигандов, перечислены в табл. 8,2. Из новых носителей предложена
активированная бромцианом сефароза 6МВ (макро-гранулированная сефароза
6В; размер частиц 200-300 мкм); она предназначена для аффинной
хроматографии клеток. Активированная тиол-сефароза 4В (смешанный
дисульфид, образованный
Содержание агарозы, % Молекулярная масса исключения
Биогель А-0,5т Биогель А-1,5т Биогель А-5т Биогель А-15т Биогель А-50т
Биогель А-150т
10
8
6
4
2
0.5-10е 1,5.10е 5-10(r) 15- 10е 50.10(r) 150-10s
15
50
150
18fi Глава 8
Таблица 8.2
Избирательное связывание лигандов с носителями для получения аффинных
сорбентов
Тип лнганда Функцио- Производное Условия
нальная Группа сефарозы присоединения Примечания
Углеводы и другие -ОН Эпоксиактиви- 16 ч, 20-45 "С, Можно рабо-
гидроксилсодер- рованная се- pH 9-13 тать в орга-
жащие соедине- фароза 6В нических рас-
ния творителях (например, в 100%-ном
Аминокислоты и -nh2 формамнде)
Активирован- 1 ч, температу- Прямое присо-
пептиды ная СН-сефа- ра комн., единение ами-
роза 4В pH 5-9 нокислот и
-NH пептидов.
Эпоксиактиви- 16 ч, 20-45 °С, Другие функ-
рованная се- pH 9-13 циональные
фароза 6В группы (например, , COjH) не требуют за-
-nh, щиты
Белки Бромцианак- 2 ч, температу- Наиболее хоро-
тивирован- ра комн. или ший метод
ная сефароза 16 ч при 4"С присоедине-
4В и 6МВ и pH 8-10 ния белков
Аминокислоты, ке- -COjH АН-сефароза Карбодиимид, Можно рабо-
токнслоты и кар- 4В 16 ч, темпера- тать в орга-
боксикислоты тура комн., pH 4,5-6,0 нических растворителях
(например, в 50%-ном ди-
-SH оксане)
Тиол содержащие Активирован- Очень разнооб- Реакция присо-
соединения ная тиол-се- разные усло- единения лег-
фароза 4В, вия ко обратима
эпокеиактиви-
роаанная се-
фароза 6В
2,2/-дипиридилдисульфидом и глутатионом, присоединенным к активированной
бромцианом сефарозе 4В) предназначена для ковалентной хроматографии
(разд. 7.2). Производные агарозы (биогель А-15т, размер частиц 74-149
мкм), модифицированные для использования в аффинной хроматографии,
выпускаются фирмой Bio-Rad Labs, под названием аффигели (табл. 8.3).
О стабильности агарозы известно, что она устойчива в области pH 4-9; не
рекомендуются температуры ниже 0°С и выше 40 °С. Сефароза устойчива к
высоким концентрациям солей, мочевине (7 моль/л) и гуаиидинхлориду (6
моль/л) [12]. Она не
Таблица 8.3
Свойства аффигель-носителей
Длина "НОЖКИ", О А Связывание лиганда
Носитель Формула3 Концевая реактивная группа группа связывания
тип связи
Аффигель Ю Аффигель 101 106 66 1-OCHiCHjCHjNCCHjCHjCON^J |-
оснгснгснг1мнг Активированная карбоксильная в виде N-окснсук-
цииимндиого эфира Аминная Первичная алифатическая или ароматическая
аминная ^ Свободная карбоксильная Пептидная Пептидная
Аффигель 102 10" " Г алогеналкильная С-N-ковалент-ная
Аффигель 201 Аффигель 202 СД о 0 СА |-ОСНгСНгСН^НСОСНгСНгСООН NH |-
OCNH(CHz)3NH(CHjJ3NHCO(CH4)2COOH Карбоксильная В Свободная первичная
алифатическая или ароматическая аминная Тиольная Пептидная Дисульфидная
Аффигель 401 15в NH |-OCNH(CHj IjNH (СНг1,МНСОСН^тСОСН!
Сульфгидрильная Свободная тиокарб-оксильная Днсульфидная
тиосложноэфир- яая
Аффигель 501 15е . NH f-OCNH (CHjljNH (CHjljN H CO HgCl
Органомерку-ри(И) хлорид Активная сульфгидрильная
Меркаптидная
* Матрица агарозы (биогель A-tS m. 100-200 хеш).
(r) *Ножка" привязана к гелю агарозы эфирной связью.
3 "Ножка" привязана к гелю агарозы бромциановым методом,
188
Глава 8
меняется даже при кратковременном (2-3-часовом) выдерживании при
комнатной температуре в 0,1 М едком натре и 1 М соляной кислоте. Для
аффинной хроматографии веществ, слабо растворимых в воде, можно
использовать также растворы в 50%-ном диметилформамиде или в 50%-ном
