Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
| на
Цел-О- СНг- N Н- СО - N Н - белок ^елт N[jz цел_ Q- СН2 - NCO
pH S
Получив азид карбоксиметилцеллюлозы, можно превратить его
(перегруппировка Курциуса) в изоцианат, который затем связать с
аминогруппой аффинного лиганда.
Аффинные лиганды с основными аминогруппами могут быть, кроме того,
присоединены к карбоксильным группам карбоксиметилцеллюлозы в присутствии
карбодиимида '[85]
Цел-0-СНгСООН+ R-NHj-;---------------------> ifM-O-CH^-CO-NH-R +
н2о
n,n вщинлогексилкарбо-диимид
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда_____________179
Кей и Лилли [33] разработали триазиновый метод связыват ния белков. 2-
Амино-4,6-дихлор-сгиш-триазин связывается с гидроксильной группой
целлюлозы и далее реагирует с аминогруппой белка
а
CL ын-белок
V1 N I
по* л!ч 11 <5i?/70K-NHa N^N
Ки-ои * X ?-4M-°J'vV ----------------------------------"чЛХ,
Cl N NH. ^ N NHs
2-Амино-4,6-дихлор-силш-триазин приготовлен исходя из циануро-вой кислоты
и затем введен в реакцию с различными полисахаридными носителями, такими,
как целлюлоза, ДЭАЭ-целлюлоза, КМ-целлюлоза, а также сефадекс и сефароза.
Ниже приведена методика проведения реакции.
Готовят два раствора. Раствор А. 10 г 2-амино-4,6-дихлор-снл1Л1-триазина
растворяют в 250 мл ацетона при 500С и и полученному раствору добавляют
250 мл воды при той же температуре. Раствор Б. К 15%-ному (вес: объем)
раствору карбоната натрия добавляют 0,6-кратный объем 1 М НС1. К 100 мл
раствора А прибавляют целлюлозу (20 г) или КМ-целлюлозу и смесь
перемешивают при 50 °С в течение 5 мин, Затем добавляют 40 мл раствора Б
и продолжают перемешивание при 50 °С еще 5 мин. pH суспензии быстро
снижают до ^7 концентрированной соляной кислоты. После фильтрования
модифицированную целлюлозу промывают водно-ацетоновой смесью и, наконец,
0,1 М фосфатным буфером (pH 6,7), который использовался и для ее
хранения.
Связывание химотрипсина осуществляют из 1,5%-ного раствора в 0,5 М
боратном буфере (pH 8,75) при 23 °С; через 4,5 ч получают продукт,
содержащий 19 мг фермента в 1 г препарата с сохранением 70%
ферментативной активности.
Морикава и др. [42] применили дихлор-енлш-триазиновые смолы в качестве
носителей для иммобилизованных ферментов.
Ягендорф и др. [31] разработали метод связывания белков, основанный на
ац'илировании гидроксильных групп в целлюлозе бромацетилбромидом с
последующим алкилированием аминогрупп белка
Белок-NH*
Цел-ОН + Вт-СО-СН2-Вг ----* Цел-О- СО-СН2-Вг ------->-
" Цел-О-СО-СН,-NH-Белок
Описаны [64] приготовление и свойства аминоацилазы, ковалентно
присоединенной к галогенацетилцеллюлозам. Связывание белка из 0,6%-ного
раствора аминоацилазы в 0,2 М фосфатном буфере (pH 8,5) в течение 24 ч
при 7°С дало продукт, который содержал 56 мг белка-фермента на ! г
препарата с сохранением 30% активности.
180
Глава 8
Впервые присоединение аффинного лиганда к целлюлозе было осуществлено с
помощью азосочетания [7]
10 % -ный
Ц"!т-он + с(-счг/~\+юг ^л-0-сн-/~\^мог
W W \sn/Ha
ifftr-Q-CHg-^~~^-N=NCl~ <N^1°2, Д^-°~Сиг-0 ЧНг
pH"8,5 _
'^оедон-^^- он
белок
Цел-Q-CHa-^~^-N"N но
Аффинные лиганды связываются своими аром^тическнми ос* тагками (в случае
белков главным образом тиро^ином и гистидином), а также неспецифически, и
более медлен^0 своими аминогруппами [26, 73].
Нуклеиновые кислоты привязываются к амин<?этилцеллюлозе в большинстве
случаев с помощью периодатн^го окисления [22, 41]
Цел-o-CHj-CHj-NHj
хР ИаЮ4
(r)-с' "¦-------;--------
. н щелочной раствор
?(P/r-0-CHa-CHa-N=CH-(R) (тиффово
основание)
NaBHji
^ftT-O-CHj-СН4-NH-CHj-@
Хотя целлюлоза применялась как носитель пре1ш,Ущественно в начальный
период развития аффинной хроматогРаФии' она все еще используется и в
настоящее время (табл. 11.1).
В работе Лоу и др. [42] сопоставлены свойств^ сорбентов на основе
целлюлозы и сефарозы, для чего ис,пользов?У,ись экспериментальные кривые
титрования 6-аминогексил^АО+~сефарозы, немодифицированной сефарозы, 6-
аминогекса"ои^~"сеФаРозьг и соответствующих производных целлюлозы (рис.
8-0- Очевидно образование ионизирующих групп после активаций бромцианом:;
это было также показано в случае целлюлозы, ког>а для реакции
присоединения использовали днциклогексилкарб0ди'ИМИд [38]. Отклонение,
наблюдаемое для сефарозы, сущест2енно меньше,
'-Г 6н он
нух/геотидов
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
181
чем для целлюлозы; поэтому целлюлозу считают неподходящей для
приготовления аффинных сорбентов. Преимущественно неспе-' цифическая
сорбция нуклеотидов на целлюлозе с повышенным содержанием примесей
лигнина отмечалось в разд. 6.8 (табл. 6.3) [16].
Рис. 8.1. Кривые титрования 6-амино-капроннл-JMAD+-полимеров [42),
Сплошные лннян относятся к сефарозе ^ 4В и ее производным, пунктирные - к
Q-целлюлозе и ее производным; 1 - носитель с присоединенной б-
аминогексановой кислотой; 2 -носитель с присоединенной 6-амн-нокапроннл-
JsAD-.
8.2.2, Диальдегид крахмал - метилендианилин (К-МДА)
