Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
приготовлении нерастворимого аффинного лиганда важно, чтобы он
прикреплялся к носителю только ковалентной связью, а молекулы аффинного
лиганда, не связанные ковалентно, должны быть отмыты. Это трудно
осуществить, если носитель сильно адсорбирует молекулы аффинного лиганда.
Подобным образом, если выделяют вещества, образующие специфический и
обратимый комплекс со связанным аффинным лигандом, важно, насколько это
возможно, чтобы только эти вещества задерживались на колонке с
нерастворимым аффинным сорбентом и только в виде специфического комплекса
со связанным аффинным лигандом. Это является одной из причин, почему
носители, которые содержат ионогенную группу, такие, как сополимер
этилена с малеиновым ангидридом, у которого остается ряд свободных
карбоксильных групп после присоединения аффинного лиганда, никогда не
будут столь широко применяться в аффинной хроматографии, как нейтральная
агароза.
Носители должны обладать достаточным числом химических групп, которые
могут быть активированы или модифицированы таким образом, чтобы
приобрести способность связывать аффинные лиганды. Емкость специфического
сорбента, приготовленного присоединением аффинного лиганда к
нерастворимому носителю, зависит от числа этих групп. Активация или
модификация должны происходить в условиях, которые не изменяют структуру
но~
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда____________177
сителя. Не менее важны химическая и механическая устойчивость носителя в
условиях присоединения аффинного лиганда, а также при различных величинах
pH, температурах и ионных силах, в условиях возможного присутствия
денатурирующих агентов, необходимых для хорошей сорбции и элюирования
выделяемого вещества, и т. д. Возможность повторного использования
специфического сорбента зависит от такой стабильности.
Следующее требование связано с предыдущими: специфиче-
ские сорбенты не должны атаковаться микроорганизмами и ферментами. Этому
требованию лучше удовлетворяют неорганические носители, такие, как
стекло, или синтетические полимеры, такие, как полиакриламид или
оксиалкилметакрилатные гели.
Гидрофильные свойства нерастворимых носителей желательны не только
потому, что необходимо свести к минимуму неспецифическую сорбцию и
инактивацию, но также и потому, что на носителях с гидрофобными
свойствами может уменьшаться стабильность некоторых связанных ферментов в
результате денатурации, аналогичной той, которая вызывается органическими
растворителями.
8.2. ОБЗОР НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫХ НЕРАСТВОРИМЫХ НОСИТЕЛЕЙ И МЕТОДОВ
ПРИСОЕДИНЕНИЯ К НИМ
8.2.1. Целлюлоза и ее производные
Цел люлоза представляет собой линейный полимер р-1,4-свя-занных звеньев
d-глюкозы со случайными 1,6-связями:
Выпускаемые промышленностью препараты на основе целлюлозы обычно сшиты
бифункциональными реагентами, такими, как
1-хлор-2,3-эпоксипропан, и химически весьма устойчивы. Гликозид-ные связи
подвержены кислотному гидролизу, и в экстремальных условиях наблюдается
почти количественное расщепление до свободной кристаллической d-глюкозы.
При взаимодействии с окислительными агентами, такими, как перйодат
натрия, образуются альдегидные и карбоксильные группы. Целлюлоза
подвержена атаке целлюлаз, например .микробных.
Целлюлоза и ее производные производятся рядом фирм. Наряду с фирмами
Whatman (Англия) и Schleicher & Schiill (Швей-
12-6
178
Глава 8
цария) фирмой Serva (ФРГ) предлагается ряд производных целлюлозы:
бромацетилцеллюлоза (BA-целлюлоза), л-аминобензоил-целлюлоза (РАВ-
целлюлоза), бензоил-ДЭАЭ-целлюлоза (BD-цел-люлоза) и бензоилнафтоил-ДЭАЭ-
целлюлоза (BND-целлюлоза). Фирма Bio-Rad Labs. (США) поставляет л-
аминобензоилцеллю-лозу (Cellex РАВ) и аминоэтилцеллюлозу (Cellex АЕ).
Фирма Miles Labs. (Англия) производит гидразид КМ-целлюлозы (эн-зайт-СМС-
гидразид), бромацетилцеллюлозу (ВАС) и л-аминобен-зило.ксиметилцеллюлозу
(АВМС). Кроме носителей для связывания аффинных лигандов эти фирмы
производят также готовые аффинные сорбенты, как это уже отмечалось в
разд. 6.11.
Обзор связанных аффинных лигандов, преимущественно белковой природы, на
целлюлозе и ее производных сделан Сильма-ном и Качальским [67], обзор
связывания ферментов - Круком и сотр. [11], а связывания нуклеотидов,
полинуклеотидов и нуклеиновых кислот-Гиламом [22]. В этих обзорах
упомянуто много различных методов связывания. Поскольку в настоящее время
целлюлоза находит ограниченное использование в аффинной хроматографии,
здесь кратко отмечаются только некоторые из методов связывания.
Наиболее распространен метод связывания веществ со свободной аминогруппой
на целлюлозе (Цел) с использованием азид-ного метода Курциуса. Этот метод
впервые применен Мичелом и Эверсом [47]; до настоящего времени он
наиболее широко используется в модификации Хорнби и др. [29]
л., _ NaOH СН.ОН
Цел- ОН + С1-СНГСООН-^Ife/T-O-CH -COOH -*-№л-о-сн,-соосн,
на *
HjN-NHi
NaNO, т
JfejJ-0-CHj-CO-Nj" ^р/Г-O-CHj-CO-NH-NH,
