Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
носителя и метода присоединения к нему лиганда, принимая во внимание
возможность его практического применения, а также и экономические
соображения. Учитывая это, можно понять быстрые темпы развития работ,
посвященных носителям. Все большее число различных типов носителей
становится коммерчески доступно; в табл. 8.3 и 8.4 перечислены гели,
поставляемые фирмами Parmacia и Bio-Rad Labs*. Выбор нерастворимых
носителей и методов присоединения всегда зависит от того, какие гели
лучше отвечают предъявляемым к ним требованиям, при этом учитывается и
цена этих носителей. Для многих исследователей еще долго будут доступными
лишь простейшие носители, которые перед присоединением лиганда должны
быть активированы. Поэтому после вводного раздела, в котором излагаются
требования, предъявляемые к идеальному носителю, следует раздел,
посвященный наиболее распространенным носителям, методам их активации и
присоединения к ним лигандов. Поскольку несомненно, что в настоящее время
наиболее часто используемым носителем является агароза (см. табл. 11.1),
разд. 8.2.4, посвященный ей, немного более детализирован, чем другие
разделы, описывающие целлюлозу, диальдегидкрахмал - метилендианилин,
декстриновые гели, сополимер этилена и малеи-нового ангидрида,
полиакриламидный и оксиалкилметакрилатные гели и стекло. В специальных
разделах рассматриваются вопросы, касающиеся пространственных групп
(разд. 8.3), блокирующихся нереактивных трупп (разд. 8.4) и отщеплению
присоеди-
* Упомянуты только фирмы, известные автору, поэтому перечень носителей
неизбежно неполный; ни в коем случае не следует рассматривать этот
перечень как рекомендацию каких-либо отдельных фирм или продуктов.
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда____________175'
пенных аффинных лигандов (разд. 8.5). В заключительном разделе (разд.
8.6) суммируются свойства индивидуальных носителей, и особенности
методов.
8.1. ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К ХАРАКТЕРИСТИКАМ НОСИТЕЛЕЙ
Для успешного применения в аффинной хроматографии и для иммобилизации
ферментов идеальная матрица должна обладать следующими свойствами {53]:
1) нерастворимостью;
2) достаточной проницаемостью и большой удельной поверхностью;
3) высокой жесткостью и подходящей формой частиц;
4) нулевой адсорбционной емкостью;
5) химической реактивностью, позволяющей вводить аффинные лиганды или
ферменты;
6) химической стабильностью в условиях, требуемых для присоединения,
адсорбции, десорбции и регенерации;
7) устойчивостью к действию микробов и ферментов;
8) гидрофильным характером.
Полная нерастворимость существенна не только для предотвращения потерь
аффинного сорбента, но главным образом для предотвращения загрязнений
изолируемого вещества растворившимся носителем.
Достаточная проницаемость нерастворимого носителя необходима для того,
чтобы не затруднялось образование комплексов макромолекул с
комплементарными аффинными лигандами; этот вопрос детально уже обсуждался
в разд. 5.1. Высокая пористость нерастворимого носителя довольно
существенна для выделения веществ с относительно слабым сродством к
связанному аффинному лиганду (константа диссоциации ^10_3). Концентрация
присоединенного аффинного лиганда, легко доступного для выделяемого
вещества, в этом случае должна быть очень высока, для того чтобы достичь
сильного взаимодействия, которое физически задерживает выделяемые
вещества, мигрирующие по колонке.
В табл. 8.1 приведены количества химотрипсина и глицина, связанных с 1 мл
оксиалкилметакрилатных гелей, которые различались размерами пор,
молекулярной массой исключения и удельной поверхностью [80]. Очевидно,
что количество связанного химотрипсина непосредственно зависит от
удельной поверхности, максимальной для сферона .300 и сферона 500.
Количество связанного глииина указывает на сравнительно небольшие
различия в числе реакционноспособных групп для разных носителей этого
типа. В табл, 8.1 приведена также относительная протеолитиче-ская
активность.
176
Глава 8
Таблица 8.1
Количества химотрипсина и глицина, связанных с оксиалкилметакрилатными
гелями (еферонами) в зависимости от их удельной поверхности
Гель Молекулярная масса исключения Удельная Поверхность, МС/МЛ
Количество связанного глицина, нг/ил Количество связанного
химотрипсина, мг/мл Относительная [протеолятическая активность, %
Сферой 10s 108 0,96 0,5 0,73
Сферой 10э 10" 5,9 3,1 7,8 44
Сферой 700 700 000 3,6 2,8 6,7 49
Сферой 500 500 ООО 23 2,6 17.1 .37
Сферой 300 300 000 19,5 3,15 17,7 44
Сферой 200 200 000 0,6 2,3 6,9 53
Сферой 100 100 000 0,2 2,6 2,6 38
Требования жесткости и подходящей формы частиц связаны с проблемой
скорости потока. Для того чтобы аффинная хроматография протекала без
осложнений, элюент должен проникать через колонку с носителем с
достаточной скоростью, даже когда носитель содержит связанный аффинный
лиганд. Размер частиц геля должен находиться в интервале <200 и >5 мкм.
Сорбент должен 'Проявлять минимальную неспецифическую сорбцию. При
