Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
данного рецептора, или путем введения избытка аналога рецептора,
обладающего близким сродством. Частицы, изменяющие плотность, могут быть
видимы в электрон-
По О
@3 /
с г
О'
Е1 4
(c) S'
166
Глава 7
ный микроскоп, который позволяет картировать топологию рецепторов.
В модельной системе в качестве аффинного лиганда использовался гомогенный
конка-навалин А, меченный 1251. Частицы с высокой плотностью, содержащие
лиганд, приготовлены ковалентной пришивкой конканавалина А при помощи
глутарового альдегида к полифагу К29, представляющему собой стабильный
икосаэдр диаметром 450 А и плотностью 1,495 г/мл. Мембранные фрагменты
приготовлены из лимфоцитоплазматических мембран свиньи; они содержали
большое количество рецептора конканавалина А. Взаимодействие фрагментов
мембраны, несущих рецептор, с пертурбантом обратимо повышало плотность,
определяемую в градиенте хлористого цезия, от ~1,18 (для необработанных
мембран) до значений, лежащих в широком интервале; максимальная плотность
соответствует 1,30-1,40. Это относительно широкое распределение плотности
для комплекса между мембраной и конканавалнн А-полифагом К29 отражает
микрогетерогенность в распределении рецепторных центров. Введение избытка
а,а-трегалозы, которая не обладает слишком высоким сродством к
конканавалину А (/( = 5,38-103 л/моль), использовано для диссоциации
комплекса конканавалина А с его рецептором. В качестве аффинного лиганда
вместо конканавалина А можно использовать антитела, а также гибриды
антител, пептидные гормоны и т. д., можно также использовать и другие
методы связывания с частицами.
В общем рассмотренный метод может быть применен не только для выделения
рецепторных участков гормонов, передатчиков информации или сигналов,
лекарственных препаратов, лектинов и специфических антигенов и антител,
но также и для картирования топологии мембраны и клетки.
7.5. АФФИННЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Аффинный электрофорез в полиакриламидном геле - это метод разделения,
использующий преимущества и аффинной хроматографии, и электрофореза в
полиакриламидном геле [23, 24]. В микромасштабе он позволяет быстро
анализировать смеси белков с избирательным разделением тех компонентов,
которые обладают связывающими участками, комплементарными к
иммобилизованным специфическим аффинным лигандам. Последние ковалентно
связаны с частью матрицы полиакриламидного геля и образуют, таким
образом, слой "аффинного геля". Принцип этого метода хорошо
иллюстрируется на типичном примере разделения активных белков аффинным
электрофорезом, как показано на рис. 7.4. В стеклянных трубках равного
диаметра готовят
Родственные методы аффинной хроматографии
167
полиакриламидный гель с тремя слоями: крупнопористый гель (А); аффинный
гель, получаемый сополимеризацией алкенил-О-гликозидов с акриламидом с
использованием в качестве сшивающего агента N.N'-метилепбисакриламида
(?); мелкопористый гель (й). Стандартный гель, состоящий из двух слоев А
и В (трубка /), всегда используется как контрольный. Трубка 2 содержит
аффинный гель из сополимера полиакриламида с О-а-о-галактопирано-зой, а
трубка 3-аффинный гель из сополимера полиакриламида
Рис. 7.4. Электрофорез белковой фракции с гем-агглютинирующей активностью
из гороха [23] +
/ - контрольный опыт (стандартный гель); 2 - аффинный гель <5) образован
O-a-D-галактопиранозилполиакрил амидом; 3- аффинный гель (?) образован О-
a D манно знллолиакрнламидоы, А - крупнопористый гель; Б - аф-фтшый гель;
В - мелхоиористый гель; стрелки указывают границу между крупвопорветым и
аффиным гелями.
i i j
с O-ct-D-маннозой. Белковая фракция из гороха (Pisum sativum L.),
обладающая гемагглютинирующей активностью, содержит пять белковых
компонентов, как это следует из картины разделения в контрольной трубке
1. Ни один из этих компонентов не образует комплекса с а-о-галактозильной
структурой аффинного геля в трубке 2, о чем свидетельствует идентичность
электрофоретических картин разделения в трубках 1 и 2. Однако два из этих
компонентов являются фитогемагглютининами, которые взаимодействуют с a-
d-маннозильной структурой аффинного геля в трубке 3, и они поэтому
задерживаются аффинным гелем в начале трубки 3 в виде узкой полосы (на
рис. 7.4 начала аффинных гелей указаны стрелками). Подвижность остающихся
трех белков в смеси не изменяется, о чем свидетельствует распределение
полос белков в мелкопористом геле (Й).
Этот метод позволяет как обнаруживать неактивные белковые молекулы, так -
и, в случае субъединиц и фрагментов, решать, остаются ли их связывающие
участки неизменными, а также узнать,
168
Глава 7
какого типа аффинный сорбент следует выбрать для препаративной аффинной
хроматографии. Аналогичный метод независимо разработан Бег-Хансеном [8,
10].
Подобно аффинной хроматографии, аффинный электрофорез в геле можно
применять для определения констант диссоциации комплексов белок - лиганд.
Принцип метода заключается в изучении зависимости подвижности данного
