Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Ссфадекс G-200 7
Фосфоснолгшруваг, фруктозо-1,6-бисфосфат, аденозин-5-Днфосфат или
пнрофосфат Фосфоцеллюлоза 45
Тирозиновая тРНК Фосфоцеллюлоза 62
164
Глава 7
элюирующей среды, для любой системы можно теоретически найти условия
образования комплекса фермент-аффинный лиганд. Однако на практике для
того, чтобы содержание примесных бел-¦ков в элюате было минимальным,
ионную силу раствора следует поддерживать низкой. Уравнение (7.3)
выведено в предположении, что концентрации свободного фермента в
уравнениях (7.1) и (7.2) равны. В действительности это является
предельным случаем для эффективного элюирования; [Е] в уравнении (7.2) не
должно превышать [Е] в уравнении (7.1), потому что в противном случае
фермент оставался бы связанным с полимером. Необходимая для эффективного
элюирования концентрация аффинного лиганда может быть определена.
Очистка данного фермента, как правило, определяется специфичностью
взаимодействия фермент'-аффинный лиганд, как и для других аффинных
методов. Если могут образоваться несколько комплексов, например E]L и
E2L, то трудно определить порядок элюирования ферментов, потому что на
практике трудно найти значение Kt- Если предположить, что /С} - константа
ассоциации фермента Е[ с полимером, а К\-константа ассоциации фермента Е2
с полимером, то при существенных различиях их значений ферменты можно
легко разделить простой хроматографией в градиенте соли; при их
приблизительном равенстве, оба фермента будут элюироваться одновременно,
а если К1>К2, то Ei элюируется первым. Так, например, при сорбции на
аффинном полимере, несущем NAD+ в качестве общего лиганда, можно отделить
гли-церальдегидфосфатдегидрогеназу (/CmNAD = 5- 10-s моль/л) от
лактатдегидрогеназы (KmNAD= 1 • 10-4 моль/л), применяя в качестве элюента
0,15 мМ NAD+ [31]. В этом случае К\ равна '/г К(r). Подобным образом
фруктозо-1,6-дифосфатаза может быть отделена от альдолазы [34] и от
пирунагкиназы [12], если для элюирования использовать низкую концентрацию
фруктозо-1,6-дифосфата, а в качестве полимера - катионообменник.
Типичным примером использования биоспецифического элюирования является
выделение аминоацил-тРНК-синтетаз [53]. Эти ферменты взаимодействуют с
тремя различно заряженными субстратами - транспортной РНК, АТР и
аминокислотами. Аминокислоты не подходят для элюирования синтетаз с
анионообмен-ников, потому что при нейтральных pH они существуют в виде
цвиттер-ионов и сами адсорбируются. Следовательно, 2-аминоэта-нол,
например, использовался для элюирования сериновой тРНК-синтетазы,
фенилэтиламин - для фенилаланиновой тРНК-синте-тазы и тирамин - для
тирозиновой тРНК-синтетазы. Эти амины являются конкурентными ингибиторами
реакций амнноацилиро-вания соответствующими аминокислотами [54].
Другие примеры выделения веществ аффинным элюированием даны в табл. 7.3.
Родственные методы аффинной хроматографии
165
7.4. АФФИННАЯ ПЕРТУРБАЦИЯ ПЛОТНОСТИ
Мембраны животных клеток содержат генетически регулируемые специфические
системы, которые содержат рецепторы гормонов, токсинов, лекарственных
веществ и т. д. В настоящее время уделяется большое внимание
исследованиям структуры и функции этих систем. В работах Валлаха и сотр.
[57-59] разработан метод, позволяющий фракционировать мембранные
фрагменты,
Рис. 7.3. Принципы аффинной пертурбации плотности Г581.
Плазматическая мембрана, несущая большое число рецепторов, нарезается на
мембранные фрагменты, несущие различное число рецепторов с разным
распределением. Фрагменты реагируют с лигандом, связанным с пертурбантом
плотности, например, с фагом К29; образуется комплекс мь-мбрана-рецептор-
лиганд-фаг с белее высокой плотностью, чем плотность самой мембраны, и
более низкой плотностью, чем плотность пертурбанта. Добавление инзкомоле-
кулярного агента, приводящего к диссоциации, возвращает мембрану н
нертурбант плотности к их исходной плотности. / - лертурбант плотности,
например лиганд -фаг; 2 - аналог рецептора лиганда; 3 - мембранная
везикула, несущая рецептор лиганда; 4 - лиганд; 5 - фаг К29,
¦несущие специфические рецепторы, и этот метод получил название "аффинной
пертурбации плотности".
Принцип фракционирования схематически показан на рис. 7.3. Вначале
мембраны физически нарезают на крошечные везикулы. Частицы высокой
плотности, с которыми ковалентно связан специфический для выделяемого
рецептора аффинный лиганд, добавляются к мембранным фрагментам, несущим
данный рецептор. Образующийся между добавленным аффинным лигандом и
мембранными частицами комплекс быстро отделяется на ультрацентрифуге,
поскольку имеет большую плотность. Для того чтобы избежать трудностей,
обусловленных небольшими количествами соответствующих рецепторов,
мембраны и аффинные лиганды метят разными радиоактивными изотопами.
Образование комплексов между мембранными фрагментами и аффинными
частицами может быть блокировано или, если необходимо, исключено путем
добавления реагентов с более высоким сродством к аффинному лигаиду, чем у
