Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
групп, расположенных в связывающем участке фермента, то любой
ионообменник -может рассматриваться в качестве аффинного полимера,
содержащего "общие лиганды". Когда образуется комплекс белка со свободным
аффинным лигандом, заряженные группы в его связывающих центрах становятся
защищенными от взаимодействия с ионооб-менником. Это защита может быть
обусловлена стерическимв факторами или, в наиболее благоприятных
ситуациях, нейтрализацией противоположными зарядами на аффинном лиганде.
Если различия в доступности заряженных групп в ферменте и в комплексе
фермент - аффинный лиганд значительны, то фермент
Родственные методы аффинной хроматографии
161
может быть связан в таких условиях (pH и ионная сила), когда комплекс
фермент - аффинный лиганд не связывается. Трудно определить заранее
степень, до которой должен быть изменен заряд фермента, чтобы
предотвратить его связывание на сорбенте. Максимальное число зарядов на
аффинном лиганде, необходимое для предотвращения связывания фермента с
ионообменником, равно четырем для очистки фруктозо-],6-дифосфатазы
элюированием фруктозо-1,6-дифосфатом, трем для выделения изоцитратде-
гидрогеназы элюированием изоцитратом натрия или цитратом натрия и двум
для элюирования глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы глкжозо-6-фосфатом.
Поскольку наиболее эффективными аффинными лигандами для элюирования
являются те, которые содержат заряженные группы, 'идентичные заряду
ионообменника (положительно заряженные группы в случае анионообменников и
отрицательные в случае катионообменников), было высказано предположение,
что десорбция обусловлена различием в суммарном заряде на свободном
ферменте и в заряде комплекса фермент - аффинный лиганд. Теоретически,
однако, даже нейтральный лиганд может привести к десорбции фермента, если
заряженные группы, ответственные за адсорбцию, расположены в участке,
связывающем аффинный лиганд, и если после образования комплекса они
стерически защищаются от взаимодействия с ионооб-менником или если
происходят конформационные изменения, которые предотвращают
взаимодействие заряженных групп с ионообменником [54, 55].
Наряду с различиями в зарядах фермента и фермент-субстрат-ного комплекса
на эффективность элюирования влияют также сила связи между ферментом и
ионообменником и сродство фермента к аффинному лиганду. Имеют место
взаимозависимые равновесия фермента Е, связанного с ионообменником IE
[уравнение
(7.1)], и фермента, связанного с лигандом L в растворе [уравне-
В этом случае ионообменник рассматривается как макромолекула, содержащая
конечное число связывающих участков. Это предположение является верным
для данных конкретных условий, а именно при данных pH, ионной силе и
определенном (точно известным) количестве фермента, связывающегося с
полимером. Поскольку Ki непрерывно уменьшается с ростом ионной силы
ние (7.2)]:
к [Е - IE] [Е] [IE]
(7.1)
(7.2)
(7.3)
ll-б
Применение аффинного элюирования для выделенвя ферментов
Таблица 7.3
Выделяемые ферменты Афииный лиганд для элюирования Сорбент
Литератур
Альдолаза Фруктозо-1,6-дифосфат К.М-целлюлоза 34, 35
Аминоацил-тРНК-синтетазы тРНК Фосфоцеллюлоза 53
Аминоацил-тРНК-синтетазы (аргининовая гнстн-диновая, изолейциновая,
лейциновая, лизиновая, фенилаланиновая, сериновая, треониновая, ти-
розиновая и валериановая кислоты) Нефракционированная тРНК.
Фосфоцеллюлоза 54
Амилаза из Pseudomonas saccharophila Растворимый крахмал
Нерастворимый крахмал 51
Дифосфопиридиннуклеотидспеинфичная изоцит-ратдегидрогеназа (КФ 1.1.1.41)
Цитрат Фосфоцеллюлоза 2
Фруктозо 1,6-дифосфатаза (КФ 3.1.3.11) из Фруктозо-1,6-дифосфат КМ-
целлюлоза 34 - 38, 45
печени кролика мышцы кролика > " Фосфоцеллюлоза 16
Candidaulilis " " 43, 44
Polysphondylium pallidum " " КМ-сефадекс 42
Глкжозофосфатнзомераза ( d -глкжозо-6-фосфат-кетолизомераза, КФ 5,3.1.9)
из
лейкоцитов человека Глюкозо-6-фосфат Фосфоцеллюлоза 52
эритроцитов человека То же " 2, 33
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49) из печени крысы Г люкозо-6-
фосфат КМ-целлюлоза 30, со
Неорганическая пирофосфатаэа из дрожжей
NADP-зависнмая изоцнтратдегидрогеназа нз цитоплазмы печени свиньи
Нуклеаза из куриной поджелудочной железы
Оротатфосфорибозилтрансфераза (КФ 2.4.2.10)
Оротиднлатдекарбоксилаза (оротидин-5-фосфат-декарбоксилаза, КФ 4.1.1.23)
Фосфоглицераткииаза из мышц млекопитающих, рыб и кур, печени
млекопитающих и дрожжей
Пируваткиназа {АТР-пируиатфосфотрансфераза, КФ 2.7.1.40) из печени крысы
Пируваткиназа (АТР-лируватфосфотрансфераэа, КФ 2.7.1.40) из печени крысы
Пир уваткиназа (АТР-пируватфосфотрансфераза,
КФ 2,7.1.40) из печени крысы
Тирозил-тРНК-сннтетаза (КФ 6.1.1.1.) из пекарских дрожжей
Пирофосфат Гель гидроокиси алюминия 20
Изоцитрат натрия КМ-целлюлоза 25
Рибонуклеиновая кислота Фосфорилированная целлюлоза 14
Оротовая кислота ДЭАЭ-целлюлоза 11
Оротовая кислота ДЭАЭ-целлюлоза II
Отрицательно заряженные субстраты Фосфоцеллюлоза 47
Фруктозо-1,6-дифосфат КМ-целлюлоза 12
