Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
основе агарозь; присоединением алифатических аминов, триптофана и его
эфиров и т. п. Следовательно, неионные амфифильные гели демонстрируют
"чистое" гидрофобное взаимодействие с гидрофобными областями на
поверхности белковых молекул или других растворенных веществ вместо
смешанной ионно-гидрофобной адсорбции производных агарозы. В определенных
условиях адсорбционная емкость амфифильных гелей по белкам может быть
очень высока. В качестве примера Порат и др. [40] приводят хроматографию
экстракта фасоли на бензиловом эфире сефарозы 6В. В присутствии ЗМ
хлористого натрия сорбция экстракта и элюирование отдельных фракций
осуществляется путем повышения pH, снижения ионной силы и уменьшения
полярности растворителя. После использования этой колонки более 20 раз и
с 50-кратным количеством белка (относительно сухого веса геля)
гидрофобный сорбент не изменяет своих хроматографических свойств.
Принцип, который лежит в основе высаливающей адсорбции, до конца не ясен.
Очевидно, главной движущей силой является возрастание энтропии вследствие
изменения структуры воды, окружающей гидрофобные группы. Гидрофобная
хроматография может иметь 'преимущества в растворах с высокой ионной
силой, которые используются при выделении нестабильных ферментов,
например а-изопропилмалатизомеразы [4], требующих для стабилизации
высоких концентраций солей.
Из вышеизложенного следует, что в гидрофобной хроматографии необходимо
делать различие между сорбентами только с гидрофобными группами и
сорбентами, содержащими наряду с гидрофобными также ионные группы. К
носителям последнего типа Хьертен [21] относит также бензоилированную
ДЭАЭ-цел-люлозу (предложена Гиллемом и др. [18] для фракционирования
транбпортных РНК), полиакриловую кислоту со связанными алифатическими
аминами (использована для хроматографии митохондриальных мембранных
белков [61]) и сукцинилированную аминодецилагарозу (использована Ионом
[63] для очистки транс-карбамилазы). Эти и другие подобные примеры
перечислены в
Родственные методы аффинной хроматографии
157
табл, 11.1, которая включает также выделение (3-галактозидазы на сефарозе
4В со связанным после активации бромцианом я-лро-цнламином [41]. На рис.
7.2 показано влияние концентрации различных анионов на сорбцию р-
галактозидазы на этом сор-
Рис. 7.2. Влияние нейтральных солей на адсорбцию [41].
100 мкл суспензии тримстнлендиамлн- сефарозы 4В, на которой уже
адсорбировалась р-галактозидаза [0.24 ед./мл), добавлялись к 0,5 мл
стандартного буфера [0,01 М трис-ацегат (pH 7,1), со держащий 0J моль/л
NaCl, 0,01 ноль-'л MgCh к 0,0] моль/л (З-меркаптоэтанол!
"месте с раствором, содержащим 0,1 М NaCl и различные концентрации
нейтральных содей (pH, если требовалось, доводили до 7,1), Использовались
соли ки.шя; на рисунке указаны только анионы. После 15 мин инкубации при
комнатной температуре в супернатанте, полученном фильтрованием,
определяли ферментативную активность, Активность дана в процентах к
исходной адсорбированной активности,
бенте. Большое влияние оказывает природа анионов, которые могут быть
расположены в следующий ряд по создаваемому ими эффекту уменьшения
десорбции: роданид- иодид>хлорид>аце-тат>цитрат. Этот ряд идентичен
гофмейстеровскому лиотропному ряду для нейтральных солей [19]. Влияние
анионов на адсорбцию белков на алкилсефарозе очень близко лиотропным, а
не чисто электростатическим эффектам.
Таблица 7.2
Активность ферментов метаболизма гликогена, которая может быть элюирована
растворами соли в различных концентрациях с метиламин-сефароэ,
характеризующихся возрастающей гидрофобностью
Содержание NaCl 1 Содержание s буферных растворах, метиламиНа
используемых для в ссфарозе. ступенчатого мкмоль/мл элюирования, моль/л |
Активность, единиц на мл сефарозы3
фосфорн- лаэа Ь ниназа фосфори- лззы фосфатаза фосфо- рилазы
протеин- киназа "Гликоген- еннтетаза
0,050 5,7 6,5
12.1 0,8 301 0,12 0,147 21,7
20.0 0,65 6554 2,0 1,4 146
32,5 32,0 353 0,3 0,014 32.0
0,12 5,7 - - -. - -
12,1 7,3 - - -
20,0 - 2839 1.6 1,2 58.0
32,5 16,0 1304 1.8 0,04 35,0
I 5,7 - - - - ¦-
12,1 - 3,6 - -
20,0 - 210 1,2 0,09 12,0
32,5 14,0 6666 16,6 4,2 161
Тире указывают, что активность ферментов не обнаруживается в элюате.
Данные, приведенные в табл. 7.2, иллюстрируют влияние концентрации соли
на ступенчатое элюирование ферментов метаболизма гликогена с различных
метиламин-сефароз, характеризующихся возрастающей гидрофобностью [27].
7.2. КОВАЛЕНТНАЯ АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Избирательное выделение биологически активных макромолекул аффинной
хроматографией основано на обратимых взаимодействиях между
иммобилизованным аффинным лигандом и свободной макромолекулой. Однако
принцип аффинной хроматографии может быть также использован даже с
сорбентом, который содержит "необратимый" ингибитор, когда после сорбции
комплементарной макромолекулы в специфическом комплексе образуется
ковалентная связь. Для освобождения выделяемого вещества из комплекса с
