Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
"карманов".
Предположение, что гидрофобные взаимодействия играют ключевую роль в
разделении, достигаемом на агарозах ш-аминоал-кильного ряда, подтверждено
несколькими наблюдениями. Во-первых, для освобождения некоторых белков,
удерживаемых этими
154
Глава 7
колонками, недостаточно сведения к минимуму йот ств'ИЙ применением
элюентов с высокой концен Например, белок J из Salmonella typhimurium,
кширп" нр.
7,0 заряжен отрицательно, фактически не задерживается в
о-аминоалкилагарозами при низкой ионной силе даже несмелр на то, что при
этом pH эти агарозы заряжены положительно. Хо..
Рис. 7.1. Хроматография липофильны белков на каприлгидразид-агаро зе
[32J¦
Хроматографические исследования прово дилнсь в колонках {90X16 ни} с
гелям" 4%-кой. агарозы, содержащими 5.5 мкэкв/м. капрвлата. Гели
промывались 0,05 К Na-ацетатиым буфером (pH 6.0). Введение белков (5-10
мг) указано стрелками. Ско рость потока постоянна и равна 43 мл/ч.
Регистрировалась оптическая плотность элюатов при 280 нм. Для целей
сравнения были осуществлены три отдельных хроматографирования. ЯА -
яичный альбумин. ЛГ - лактоглобулин, БСА - бычий сывороточный альбумин,
GuCi - гуакндинхлорид.
элюирования, наблюдаемый при разделении белков на ы-амино-алкилагарозах,
отличается от элюирования с ДЭАЭ-целлюлозы, на которой разделение белков
основано на ионных взаимодействиях. Тем не менее именно ДЭАЭнЦеллюлоза,
содержащая диэти-ламиноэтильные группы, может действительно представлять
особый случай смешанного ионного и гидрофобного сорбента. Эти особенности
ДЭАЭ-целлюлозы могут объяснить наблюдаемые иногда отклонения в связывании
белкенз ионообменником, например связывание в "неправильной"
(относительно изоэлектрической точки) области pH. Более того, ряд ю-
аминоалкилсефароз демонстрирует различную степень удерживания
специфических белков, связанную с увеличением длины и-аминоалкильных
цепей. Этот факт подобен тому, который наблюдался в ряду алкил-агароз.
Хофсти [22] показал, что белки значительно отличаются по своей
гндрофобности, которая может быть измерена на основании
Объем элюирования, мл
Родственные методы аффинной хроматографии
155
Таблица 7.1
Адсорбция белка как функция концентрации аффинного лиганда1
Адсорбцкя белка при концентрации <мк"кв/мл) лиганда
Белок6 5,5 2.7 1,5
Бычий сывороточный альбумин р-Лактоглобулин р-Лактоглобулин + + 3 М NaCl
Связывается Задерживается Связывается Задерживается Не связывается
Слабо задерживается Не связывается Не связывается Не связывается
а Термин "связывается" означает, что "задерживается" - в *не
свя"
зыва ется " - Ve = V ^.
6 В виде раствора в 0,05 М ацетате натрия (pH 6,0).
их адсорбции на гидрофобных гелях. Нишикава и Бейлон [32] подтвердили
наблюдение Хофсти, что для трех тестируемых белков порядок возрастания
гидрофобности следующий: овальбу-
мин<Гр-лактоглобулин-<бычий сывороточный альбумин; данные получены на
неионном гидрофобном геле (сефароза 4В со связанным каприлгидразидом). Из
рис. 7.1 следует, что 4%-ный гель агарозы, содержащий 5,5 мкэкв.
каприлата в 1 мл, связывает бычий сывороточный альбумин очень сильно и
для его десорбции требуется 3 М гуанидннхлорид; р-лактоглобулин отстает
от фронта растворителя в своем движении через сорбент, в то время как
овальбумин элюируется без отставания.
В табл. 7.1 [32] дана адсорбция бычьего сывороточного альбумина и р-
лактоглобули-на как функция содержания кзприлгид-разида в 1 мл сефарозы
4В. Поскольку текстнруемые белки отличаются своими гидродинамическими
размерами, для оценки их хроматографического поведения сопоставляются
экспериментально определяемые объемы элюирования Ve и 1/s, т. е. объемы
элюирования белка с колонок, предварительно уравновешенных 2 М I
уанидинхлоридом. В этом растворе все белки движутся и не задерживаются
сорбентом.
Чувствительность адсорбции бычьего сывороточного альбумина к небольшим
изменениям концентрации лиганда может быть следствием одновременных
взаимодействий сорбента с множеством участков на белковой молекуле. Для
р-лактоглобулина влияние концентрации лиганда более выражено, если в
буферном растворе присутствовал 3 М хлористый натрий. Высаливающее
действие хлорида натрия известно, поэтому присутствие этой соли повышает
адсорбцию р-лактоглобулина на гидрофобном сорбенте.
156
Глава 7
Обсуждая влияние солей, следует отметить, что фрак i вапие белков
основано на гидрофобной высаливающей ад на неионных амфифильных гелях,
для которой Порат и ввели термин "гидрофобная высаливающая хроматограф
фифиль'ные гели получаются при введении ограниченно! i:ic,i
гидрофобных групп в вещества, которые используются ка лдро
фильные гели, при этом образуются сшитые полимеры, обладай щие высокой
проницаемостью и способные набухать как в ВОД1, так и во многих
органических растворителях. В водных растворах они проявляют сродство к
растворенным гидрофобным веществам и соединениям с гидрофобными группами.
Они не содержат ионных групп в отличие от сорбентов, приготовленных на
