Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
или "мерной линейкой" различного размера и протяженности, которая
взаимодействует с доступными гидрофобными "карманами" или гидрофобными
участками различных белков. Задержка или удерживание белков на сорбенте
достигается благодаря липофильным взаимодействиям между этими "карманами"
и достаточно большими углеводородными боковыми цепями на нерастворимом
носителе. Шальтье [48] исходил в своих предположениях из следующих
наблюдений:
1. Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН-сефароза (где п принимает
значения от 0 до 7), ш-аминоалкилагароз со структурой NH2(CH2)niNH-
сефароза {где " - от 2 до 8) характеризуется близким содержанием
алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях
(pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность
СНз(СН2)"ГШ-сефарозы удерживать фосфорилазу b зависит от длины
углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы ("=0 или
1) фосфорилаза b выходила из колонки с фронтом растворителя; при п = 2
происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался.
Элюирование фосфорилазы b с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с
помощью "деформирующих" буферных растворов, которые, как было показано,
приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном
сефарозы с п = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что
фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного
раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера
намного выше. Освободить фосфорилазу b из комплекса с этим производным
можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной
кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил-
или ариламинов на активированной бром-циапом агарозе вводит в гель
положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим Пост и др. [28]
обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламииами, прикрепленными
после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков
происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых
белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические
взаимодействия с положительно заряженной N-замещенной изомочевиной более
существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной
боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь,
пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой
минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере
присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они
не могут быть причиной различий в степени
Родственные методы аффинной хроматографии
153
задержки на колонке, которая обусловлена главным образом длиной
гидрофобной цепи.
2, Поскольку нет никакого подобия между четырехуглеродной алкильной
группой в цепи алкилагароэы и известными субстратом или эффектором
фосфорилазы b и поскольку в тех же условиях на этом типе колонок
связываются также и другие белки, то такое взаимодействие с носителем,
по-видимому, объясняется не только связыванием в каталитическом или
регуляторном центрах. Тот факт, что некоторые ферменты сохраняют свою
каталитическую активность даже после сорбции на гидрофобном сорбенте,
также согласуется с этим предположением.
3. Белки с одинаковым зарядом и молекулярной массой для удерживания на
алкилагарозных колонках требуют "ножек" различной длины.
4. Связываемость данного белка увеличивается до определенного предела с
удлинением гидрофобной "ножки"; это показано десорбцией белка с колонки,
для которой необходимы жесткие условия,
5, Белки, связанные в колонке с алкилагарозой, можно десорбировать,
повышая гидрофобность элюента.
На картину элюирования с алкилагароз сильно влияют ионные взаимодействия,
которые, однако, не обязательно приводят к повышению аффинности колонки,
а скорее вызывают обратное. Например, гликогенфосфорилаза b удерживается,
как уже отмечалось, на алкилагарозе, которая содержит четыре углеродных
атома в цепи. В ряду (о-аминоалкилагароз фермент удерживается только на
шестиуглеродной боковой цепи. Подобным образом гликогенсинтетаза
связывается с CH3NH-сефарозой, в то время как в ряду ю-аминоалкилсефароз
существенное связывание наблюдается на NH2(CH2)4NH - сефарозе.
Введение заряженной группы в конец углеводородной цепи ие только приводит
к появлению ионных взаимодействий, но и уменьшает, кроме того,
гидрофобные свойства колонки. В некоторых случаях сорбированные белки
можно освободить из комплекса с алкилагарозами путем увеличения ионной
силы элюента или путем изменения его pH. В этих случаях Шальтье считает
возможным, что ионные взаимодействия прямо ответственны за сорбцию
макромолекул на модифицированной агарозе. В белках, конформационное и
агрегационное состояния которых сильно зависят от внутримолекулярных
ионных взаимодействий, вероятно, ионная сила и pH влияют на структуру
молекулы и поэтому изменяют размер и доступность их гидрофобных
