Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
матрицей полисахаридного носителя, что пред-
Рис. I. Хроматография L-лактат- и L-аланиндегндрогеназ на сефарозе с
привязанными производными АМР.
1 - лактатдегидрогеназа из мышцы кролика; 2 - аланнндегидрогеназа В.
subtilis; 3 - бычий сывороточный альбумин; 4 - градиент NADH.
отвращает взаимодействие аффинанта с комплементарным ферментом.
Рис. 3 наглядно иллюстрирует неспецифическое и специфическое
взаимодействия между ферментом и аффинным адсорбентом. На верхнем рисунке
показана неспецифическая многоточечная связь между инертными белками и
иммобилизованными аффинными лигандами. На среднем рисунке изображены
множественные связи фермента, который хотя и содержит участок,
комплементарный иммобилизованному аффинному лиганду, однако сорбирован в
неправильной ориентации. Неспецифические связи, образующиеся
448
Дополнения
с группами подлинного аффинанта, пространственной группой или носителем,
могут быть обусловлены электростатическими и гидрофобными
взаимодействиями или их комбинацией, а также другими взаимодействиями.
Неспецифические множественные связи могут
Число метиленовых групп в пространственной группировке
Рис. 2. Взаимодействие лактатдегидрогеиазы с 8-(<и-аминоалкил)-АМР,
содержащей полиметиленовуго группировку различной длины.
быть сильнее одной специфической связи между выделяемым ферментом и
иммобилизованным аффинным лигандом. На нижнем рисунке для сравнения
показана специфическая комплементарная связь выделяемого фермента с
иммобилизованным лигандом. При низкой концентрации привязанного аффинанта
множественные неспецифические связи не могут реализоваться, поэтому
происходит только биоспецифическое связывание молекул фермента по
активному центру, если, конечно, образование такой связи стери-чески
возможно. Дело в том, что из-за неравномерной поверхности геля, например
макросетчатого полимера оксиалкилметакри-латного геля (рис. 3), связанные
через пространственную группу аффинные лиганды делятся на хорошо
доступные, менее доступные и стерически недоступные. Пространственные
препятствия могут быть одной из причин не только низкого насыщения
иммобилизованных молекул аффинанта выделяемым ферментом, но также их
гетерогенной аффинности. Поэтому нужно подходить к каждо-
Дополнения
449
а
в
Рис. 3. Характер связей, образующихся при связывании фермента на аффинном
сорбенте.
а - неспецифическая связь фермента на неспецифическом аффинном сорбенте;
б - неспенн-фическая связь фермента на специфическом аффинном сорбеите; в
- специфическая связь фермента на специфическом аффинном сорбенте.
му разделению аффинной хроматографией индивидуально и устанавливать как
оптимальную концентрацию аффинанта, так и характер и длину
пространственной группы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lowe С. R., Eur. J. Biochem., 73, 265-274, 1977.
Дополнения
К главе 8
Большой интерес представляет применение магнитных полимеров в качестве
носителей для биологических молекул. -Преимущество таких препаратов
состоит в легкости их выделения при наложении магнитных полей. Мосбах и
Андерсон [1] разработали общий метод применения магнитных жидкостей,
позволяющий намагничивать полимеры после их модифицирования
биологическими молекулами. Магнитные жидкости - это жидкости, состоящие
из взвешенных ультрамикроскопических частиц (- 100 А) магнитной окиси
железа. Частицы магнитной жидкости стабилизованы .покрытием толщиной 25
А, предотвращающем их слипание в магнитном поле. Эти частицы удерживаются
в виде коллоидной суспензии за счет броуновского движения. Магнитные
жидкости (феррофлюиды), содержащие частицы феррита, были использованы в
виде коллоидов в воде или углеводородах. Они ведут себя как истинно
гомогенные жидкости, однако весьма чувствительны к воздействию магнитного
поля. Для получения магнитного аффинного сорбента сорбент на основе
сефарозы обрабатывают феррофлюидом с последующим намагничиванием в
магнитном поле. Использование магнитных полимеров в аффинной
хроматографии позволяет быстро "вытаскивать" молекулы из коллоидных
растворов или растворов с культурами клеток и мицелием. Такое быстрое
"вытаскивание" молекул очень трудно достижимо или совершенно невозможно
.при обычных методах выделения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mosbach К., Anderssori L., Nature, 270, 259-261 (1977).
К главе 9
Кон и Вилчек Ш разработали колориметричеокий метод контроля активации
полисахаридных носителей бромцианом, основанный на образовании темно-
красного комплекса, имеющего ?575 15000 моль-1-л-см-1, при/взаимодействии
.цианатных эфиров с пиридином и барбитуровой кислотой [2]:
Реагент для качественной реакции
12 мл пиридина медленно смешивают с 2,5 мл конц. НС1 (ч.д. а.), затем
добавляют 0,5 г барбитуровой кислоты и доводят объем до 20 мл
дистиллированной водой. После перемешивания примерно в течение 10 мни
получают прозрачный бесцветный раствор. При хранении в холодном темном
месте раствор устойчив о течение нескольких недель в зависимости от
чистоты используемых реактивов. Небольшое окрашивание реагента не мешает
