Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 182

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 176 177 178 179 180 181 < 182 > 183 184 185 186 187 188 .. 198 >> Следующая

служить простыми моделями биологических систем, которые находятся в живых
клетках. Действительно, синтетические полимерные матрицы точно не
воспроизводят ситуацию in vivo, однако исследование таких моделей
является важным этапом в рассмотрении ферментативного катализа как
гетерогенного процесса [38]. Прежде всего они механически более
устойчивы. Хорошо определенная химическая структура матриц позволяет
изучать влияние только одного параметра, такого, как влияние
гидрофобности или влияние заряженных частиц на ферментативное действие.
Можно также изучать влияние микроокружения матрицы, а также эффекты,
возникающие благодаря различным локальным концентрациям субстрата,
продукта, протонов эффекторов и т. д. Эти различия в локальных
концентрациях возникают в результате каталитической активности ферментов
или влияния соседних молекул ферментов. Влияние микроокружения на
активность и стабильность иммобилизованных ферментов детально обсуждается
в разд. 12.2 и 12.3. Влияние, оказываемое матрицей, с трудом можно
отличить от влияния микроокружения, создаваемого в результате собственно
ферментативной реакции как самого фермента, так и других окружающих
ферментов.
Поскольку многие ферменты производят или цепользуют протоны, возможно,
что такое их действие могло бы модифицировать активности других ферментов
и таким образом регулировать метаболические дути. Гестрелиус и др. [14]
использовали модельную систему, содержащую включенные гексокиназу,
глкжозооксидазу и трипсин. При pH 8,6 (оптимальное значение для
гексокиназы) 15% добавленной глюкозы фосфорилируется, а остальная
окисляется глкжозооксидазой (оптимум pH 6,6). После добавления субстрата
трипсина его гидролиз приводит к накоплению протонов в микроокружении
утилизирующих глюкозу ферментов. Хотя внешний pH поддерживается
постоянным при 8,6, подкисление микроокружения ведет к уменьшению
гексокиназной активности с одновременным возрастанием глюкозооксидазной,
что приводит к полному окислению .глюкозы.
Иммобилизация двух последовательно работающих ферментов на одной матрице
может служить простой моделью ситуации in
440
Глава 12
vivo, когда ферменты расположены в последовательном ряду на мембранах или
внутри гелеобразных структур. Впервые такая двухстадийная ферментативная
система описана Мосбахом и Ма-тиасоном [41]:
гексокиназа "
Глюкоза Глюкозо-6-фоарат
АТР ДОР
глюкозо-б'фостатдегидрогенаэа.
----------------------------- б-Фос<рогдюнонолактон
NADP+ NAOPH+H-'"
Ферменты иммобилизованы с помощью ковалентной связи с бром-
цианактивированной сефарозой или включением в сшитый полиакриламид.
Скорость суммарной реакции, катализируемой ферментами, присоединенными на
одном носителе, сравнима со скоростью, получаемой, если взяты свободные
ферменты в количествах, эквивалентных по активности (в единицах на объем
инкубационного раствора) ферментам в иммобилизованной системе. Другие
системы, взятые для сравнения, составлены из индивидуальных ферментов,
иммобилизованных на отдельных полимерных частицах. Все системы достигали
окончания лаг-периода раньше стационарного уровня производства NADPH.
Однако система, в которой ферменты иммобилизованы на общей матрице,
достигали стационарного состояния раньше, чем соответствующая растворимая
система или система ферментов, иммобилизованных на отдельных частицах.
Наконец, стационарные скорости во всех трех системах были одинаковыми. Из
этого следует, что в иммобилизованной системе продукт реакции,
катализируемой первым ферментом, находится в окружении второго фермента в
более высокой концентрации, чем в случае, соответствующем свободной
системе. Это может быть отнесено как к близкому расположению молекул
ферментов в иммобилизованном состоянии (при иммобилизации могут быть
достигнуты такие относительные концентрации различных ферментов, которые
не достижимы в свободном виде в растворе), так и к затрудненной диффузии
промежуточного продукта благодаря диффузионному слою Нернста вокруг
ферментполимеряых частиц в перемешиваемых растворах [38]. Таким образом,
следующий фермент в последовательном ряду действует более эффективно, и
скорость всей реакции возрастает. Эта двухферментная система была затем
расширена до трехферментной [36], включающей р-га-лактозидазу,
гексокиназу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. Й в этом случае
иммобилизованная система значительно более эффективна в начальной фазе,
чем соответствующая растворимая система.
Так называемые "искусственные ферментные мембраны" являются другим
примером интересных модельных систем.
Иммобилизованные ферменты.
441
Например, гексокиназа и фосфатаза, сшитые с инертным белком, образуют
мембраны, которые могут действовать как глюкоз-ный насос.
Мультиферментные системы важны не только теоретически, но и практически.
Так, было показано [4], что для препаративного производства глюконовой
кислоты из глюкозы более выгодно использовать двухферментную систему -
глюкозооксидазу и катала-зу, совместно иммобилизованных на одних частицах
Предыдущая << 1 .. 176 177 178 179 180 181 < 182 > 183 184 185 186 187 188 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed