Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
отдельными молекулами аффин-
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
279
ного лиганда были больше диаметра молекул выделяемого вещества. Это,
однако, не должно оказывать влияния на специфическое взаимодействие
молекулы вещества с молекулой лиганда, например активного центра фермента
с иммобилизованным субстратным аналогом. Другой способ уменьшения
неспецифической сорбции- предотвратить образование зарядов и гидрофобных
участков в иммобилизованных аффинных лигандах (разд. 5.1 и 8.3).
10.4. РЕГЕНЕРАЦИЯ И ХРАНЕНИЕ АФФИННЫХ
колонок
Наиболее общим методом регенерации колонок для повторного использования
является промывка их' либо щелочными, либо" кислыми буферными растворами,
подобно тому как это делается при приготовлении колонок. Например,
сефароза со связанным глицил-О-фенилаланином после выделения нейтральной
протеин-азы из Bacillus subtilis отмывалась буфером (pH 9), объем
которого равен двум объемам колонки, а затем другим буфером (pH S или 7),
и окончательно вновь колонка уравновешивалась буфером, используемым для
аффинной хроматографии [40]. Колонки, регенерированные таким образом, не
меняют своих хроматографических свойств даже после 50 рабочих циклов.
Бенсон и др. [4] использовали промывание 6 М гуанидинхлоридом и повторное
уравновешивание исходным буфером для регенерации 19-нортестосте-рон-17-О-
сукцинилдиаминодипропиламиноагарозы. Туркова и др. [38, 39] также
использовали 6 М гуанидинхлорид для регенерации специфических сорбентов.
После экспериментов, включающих элюирование детергентами, фирма
^Pharmacia рекомендует проводить следующую процедуру промывки для
регенерации сорбентов, используемых в гидрофобной хроматографии (объемы
соответствуют объему колонки):
1) промыть 1 объемом дистиллированной воды, затем 1 объемом спирта;
2) промыть 2 объемами "-бутанола;
3) промыть 1 объемом спирта, затем I объемом дистиллированной воды;
4) вновь уравновесить гель исходным буфером; колонка готова к следующему
опыту.
Скорость потока в ходе промывок может быть такой же илгг выше, чем
используется при хроматографии; считается подходящей скорость 25-50 см/ч.
Нерастворимый аффинный лиганд, особенно если это белок, часто более
стабилен, будучи связанным с нерастворимым носителем, чем в свободном
виде. Во многих случаях для сохранения активности лучше всего хранить
специфические сорбенты после
280
Глава 10
подсушивания на воронке с отсасыванием при низкой температуре в
присутствии подходящего бактерицидного агента (например, 0,02% азида
натрия). Выбор буфера для хранения зависит от свойств связанного
аффинного лиганда.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Amneus И., Gabel D., Kasche V., J. Chromatogr., 120, 391-397 (1976).
2. Atidria G., Taniuchi H., Cone J. L., J. Biol. Chem., 246, 7421-7428
(1971).
3. Bennich H., Johansson S. G. 0., Advan. Immunol., 13, 1-55 (1971).
4. Benson A. M" Stirtula A. J.. Shaw R., Talalay P., Biochim. Biophys.
Acta, 348, 317-320 (1974).
5. Blumberg S., Schechter I., Berger A., Eur. J. Biochem., 15, 97-102
(1970).
6. Caron М., Гааге A., Cornillot P., Anal. Biochem., 70, 295-301 (1976).
7. Cornelius D. A., Brown W. H., Skrake A. F., Rupley J. A., Methods
Enzymol., 34, 639-645 (1974).
8. Cuatrecasas P., Wilchek М., Anfinsen C., Proc. Nat Acad. Sci. U.S.,
61, 636- 643 (1968).
9. Dawson R. М., Crone И. D., J. Chromatogr., 92, 349-354 (1974).
10. Edginton Т. B., J. Immunol., 106, 673-680 (1971).
11. Fujiwara K, Osue K-, Tsuru D., J. Biochem. (Tokyo), 77, 739-743
(1975),
12. Gorecki М., Bar-Eli A., Patchornik A., Methods Enzymol., 34, 398-401
(1974),
13. Gospodarowicz D., J. Biol. Chem., 247, 6491-6498 (1972).
14. Green A. A., J. Biol. Chem., 93, 495-516 (1931).
15. Harvey M. J., Lowe C. R., Dean P. D. G., Eur. J. Biochem., 41, 353-
357 (1974).
16. Heinzel W., Rahimi-Laridjani I., Grimminger H., J. Immunol. Methods,
9, 337-344 (1976).
17. Hill R. J., Immunol. Methods, 1, 231-245 (1972).
18. Hjersten S., J. Chromatogr., 87, 325-331 (1973).
19. Hofstee В. H. I., Advan. Exp. Med. Biol., 42, 43-59 (1974).
20. Jennissen H. P., Heilmeyer L. M. G., Jr., Biochemistry, 14, 754-760
(1975).
21. lost R., Miron Т., Wilchek М., Biochim. Biophys. Acta, 362, 75-82
(1974),
22. Kasai K.. Ishii S., J. Biochem. (Tokyo), 77, 261-264 (1975).
23. Kristiansen Т., Biochim. Biophys. Acta, 338, 246-253 (1974).
24. Lornitzo F. A., Qureshi A. A., Porter J. W., J. Biol. Chem., 249,
1654-1656
(1974).
25. Lowe C, R., Harvey M. J., Dean P. D. G., Eur. J. Biochem., 41, 347-
351
(1974).
26. Manen C. A., Russell D. H" Life Sci., 14, 1907-1915 (1974).
27. Murphy R. F., Imam A., Hughes A. E" McGucken M. J., Buchanan К¦
D"
Conlon J. М., Elmore D. T" Biochim. Biophys. Acta, 420, 87-96
(1976).
28. Nishikawa A. H., Bailon P., Arch. Biochem. Biophys,, 168, 576-584
(1975).
29. NHsslein C" Heyden B., Biochem. Biophys. Res. Comm., 47, 282-289
(1972).
30. Pensky I., Marshall J. S., Arch. Biochem. Biophys., 135, 304-310