Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 113

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 198 >> Следующая

бромцианом присоединены алкиламины. Иост и др. [21] показали, однако, что
при присоединении алкил- или ариламинов к агарозе, активированной
бромцианом, образуются сильные ионооб-менники с кажущимся р/С~Ю для
амидинового азота. Используя заряженные гидрофобные лиганды, получают
сорбенты, которые функционируют как детергенты, прочно сорбирующие
некоторые ферменты, которые частично денатурируют при выделении.
Выяснение способа прикрепления амина к бромциан-активированной агарозе
(образуется изомочевинная связь) приводит к объяснению часто наблюдаемой
неспецифической сорбции ряда соединений [28].
Нативная сефароза или сефароза, блокированная этанолами-ном сразу же
после активации бромцианом, не адсорбируют белки [16], Однако, если
сефароза не блокирована тотчас же после' активации, наблюдается
неспецифическая сорбция белков, которая становится тем сильнее, чем
больше проходит времени между активацией бромцианом и блокированием
активных центров. Препарат человеческий сывороточный альбумин-сефароза,
блокированный после 12 ч после присоединения сывороточного альбумина,
сорбирует только 0,4 мг белка на 1 мл геля.
Хейнцель и др. [16] описали подавление неспецифической адсорбции белка на
препарате человеческий сывороточный альбумин-сефароза путем нейтрализации
основных уретановых групп (которые возникают из амииокарбонатных групп,
образуемых главным образом при присоединении сывороточного альбумина к
ее-фарозе) анионным красителем голубым декстрином 2000. Иммуносорбент,
приготовленный этим способом, сорбировал 0,7-1,0 мг белка на 1 мл геля в
колонке, в то время как выделенное антитело было чистым и сохраняло свои
нативные свойства. Лорнитцо и др. [24] описали неспецифическое (ионное)
связывание субъединиц синтетазы жирных кислот на специфическом сорбенте,
приготовленном путем присоединения пантетеина к е-аминокапронил-сефарозе
с использованием больших количеств карбодиимида (этилдиме-тиламино-к-
пропилкарбодиимида).
Хофсти [19] провел подобное же исследование, касающееся не-гомогенности и
необратимости связывания белков на сорбентах, таких, как сефарозы,
замещенные н-алкиламинами или 4-фенил-я-бутиламином. Например, на колонку
(2 мл) сефарозы с присоеди-
278
Глава 10
ненным н-бутиламином наносился 0,1%-ный раствор альбумина в 0,001 М трис-
НС1-буфере, pH 8, до насыщения колонки. Нагруженная колонка содержала
>~30 мг белка (при 5°С). Приблизительно третья его часть элюировалась тем
же самым буфером, но почти 20 мг белка оставались связанными, несмотря на
интенсивную промывку, и могли быть отмыты, только когда возрастала ионная
сила элюирующего раствора. Часть оставшегося на колонке белка отмывается
0,01 М трис-НС1-буфером, однако большая часть белка отмывается 0,01 М
трис-НС1-буфером, содержащим 0,1 моль/л хлорида натрия, и очень небольшое
количество белка- 0,1 М трис-НС1-буфером, содержащим 1,0 моль/л хлорида
натрия. Эти результаты указывают на то, что часть белка освобождается на
каждом уровне ионной силы раствора, в то время как остальная часть
остается необратимо связанной в данных условиях. Подобное разделение на
фракции достигалось также при градиентном элюировании раствором хлорида
натрия. "Фракционирование" одного и того же белка Хофсти объясняет
негомогенностью связывающих центров адсорбента. Это предположение
согласуется с результатом, полученном при хроматографии 2 мг овальбумина
на той же колонке в идентичных условиях. Элюирование этого небольшого
количества белка при помощи градиента ионной силы (хлорид натрия)
происходит растворами с концентрацией соли, соответствующей элюенту,
снимающему с колонки последние остаточные количества прочно
адсорбированного белка, в случае, когда на колонку наносилось большое
количество овальбумина. Эти результаты означают, что некоторые "сильно-
связывающие" центры занимаются белком в первую очередь и что некоторые
другие участки с пониженной аффинностью занимаются при нанесении на
колонку большего количества белка. Аналогично явлениям, наблюдаемым при
элюировании растворами с различной ионной силой, с сорбентов с сильными
гидрофобными группами только часть белка может быть элюирована солевым
раствором (хлорид натрия) даже в такой высокой концентрации, как 1
моль/л, остающаяся часть белка снимается только при добавлении в элюент
агента, уменьшающего полярность (например, эти-ленгликоль). Такие же
результаты были получены и для других белков и красителя понсо S. Из
этого следует, что при нанесении на колонку небольших количеств белков
они связываются со специфическими сорбентами более гомогенно, чем при
нанесении больших. Это может означать, что уменьшение количества
наносимого белка способствует использованию преимущественно одного типа
связывающих центров адсорбента.
Если многоточечное связывание является одной из причин ¦сильного
неспецифического связывания, то одним из способов понижения последнего
могло бы быть уменьшение степени замещения так, чтобы расстояния между
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed