Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
1 0 4,90 4,35
2 3 5,05 4,50
4 57 >5,10 4,80
сефароза, полученного иммобилизацией при pH 7,2, наблюдалось плохое
разделение двух пиков с химотриптической активностью и пика с
триптической активностью. Два других пика с триптической активностью
элюировались значительно позднее при более низких pH. После обработки
этого препарата сорбента раствором химотрипсина элюирования триптической
активности одновременно с химотриптической больше не происходило. В то же
время наблюдалось хорошее разделение двух пиков с химотриптической
активностью. Если для разделения применялся препарат ингибитор
(Worthington)-сефароза, приготовленный иммобилизацией при pH в,5 и
модификацией раствором химотрипсина, разделение двух пиков с
химотриптической активностью значительно ухудшалось, также ухудшалось
разделение при использовании препарата ингибитор (Sigma)-сефароза,
полученного иммобилизацией при pH 7,2 (рис. 10.10,г).
Если фракционировались разные количества активированного панкреатического
гомогената на модифицированном препарате ингибитор (Worthington)-
сефароза, полученном при pH 7,2, то увеличение нагрузки колонки приводило
к тому, что пики с химотриптической активностью элюировались при более
высоких значениях pH (табл. 10.3) и хуже разделялись. Емкость геля
составляла 9 мг/мл. После разделения девяти проб панкреатических
гомогена-тов его емкость падала до 0,2 мг/мл.
10.2.3. Установление оптимальных условий и эффекта насыщения
Для нахождения оптимальных условий Порат и Кристиансен [32] рекомендуют
предварительными экспериментами определить емкость колонки. Это
определение лучше всего может быть осуществлено фронтальной
хроматографией на колонке с общим объемом в несколько миллилитров.
Измеряют поглощение элюатов при подходящей длине волны в УФ-области,
собирая небольшие
18*
276
Глава 10
фракции. В каждой фракции определяют активность и рассчитывают емкость по
активности, задержавшейся на колонке. Кроме того, фронтальная
хроматография может также обеспечить информацией о возможном присутствии
нескольких компонентов с идентичным сродством, но различными объемами,
при которых они элюируются. Иногда могут быть определены одновременно две
активности, например трипсина и химотрипсина, при элюировании с колонки с
иммобилизованным соевым ингибитором трипсина. Данные, полученные в
предварительных экспериментах, имеют ценность для планирования главного
эксперимента, который должен привести к максимальной очистке на колонке с
заданным объемом используемого сорбента.
В некоторых случаях обнаружено, что при использовании свежеприготовленных
сорбентов теряется часть активности выделяемого вещества, вероятно, из-за
его необратимой сорбции. Так, Го-рецкий и др. [12] описали изменчивость
конъюгата пенициллин- сефароза. л-Аминобензилпенициллин, присоединенный к
сефарозе бромциановым методом, дает очень устойчивый конъюгат, который
сохраняет свою способность специфически адсорбировать D-ала-
нинкарбоксипептидазу даже после хранения в воде в присутствии 0,02% азида
натрия при 4°С в течение нескольких месяцев. Однако найдено, что только -
~60% всех препаратов этого сорбента пригодны для немедленного
использования в аффинной хроматографии D-аланинкарбоксипептидазы, т. е.
некоторые конъюгаты необратимо сорбируют ферменты и никакой
ферментативной активности не удается элюировать, даже используя высокие
концентрации солей. Насыщение геля неочищенным ферментом (для чего
берется ~ 10-кратный избыток фермента по сравнению с используемым для
обычной очистки) превращает пенициллин-сефарозу в нормальный обратимый
сорбент, пригодный для аффинной хроматографии D-аланинкарбоксипептидазы.
Этот эффект насыщения высоко специфичен, и никакой другой инертный белок,
например бычий сывороточный альбумин, не может заменить D-аланинкарбок-
сипептидазу в необратимой сорбции. Кроме того, показано, что при хранении
гелей при 4°С некоторые из них, характеризующиеся необратимой сорбцией,
превращались в сорбенты, пригодные для нормальной аффинной хроматографии.
Это можно объяснить уменьшением числа высокоактивных сорбирующих центров
на поверхности геля, вследствие чего связывание фермента этими
модифицированными специфическими сорбентами становится обратимым.
10.3. НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ СОРБЦИЯ
Неспецифическая сорбция уже обсуждалась на ряде примеров (разд. 5.1, 5.8,
7.1 и 8.3). С одной стороны, она мешает аффинной хроматографии,
основанной на образовании биоспецифического
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
277
комплекса, а с другой - увеличивает аффинность систем со слабым сродством
(составная аффинность). Она создает возможность осуществления разделений
на основе взаимодействия участков с гидрофобной поверхностью
макромолекул, так называемой гидрофобной хроматографии, которая может
быть сравнена о такими общими методами, как ионообменная хроматография
или гель-фильтрация. Наиболее часто используемыми сорбентами в
гидрофобной хроматографии являются агарозы, к которым после активации
