Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
10.2.2. Влияние гетерогенности иммобилизованных аффинных лигандов
Когда сорбированное вещество освобождается от специфического сорбента,
следует помнить о влиянии гетерогенности иммобилизованного аффинного
лиганда [1]. На рис. 10.10 приведены результаты выделения химотрипсина и
трипсина из гомогенатов поджелудочной железы мыши на различных препаратах
сефарозы с присоединенным соевым ингибитором трипсина. Если допустить,
что различия в условиях элюирования отражают различия в биологической
активности, картина элюирования может использоваться для характеристики
молекулы. Применимость сорбента, таким образом, зависит от функциональной
гомогенности иммобилизованного аффинного лиганда.
Гетерогенйость сорбента по константам ассоциации может быть следствием:
1) гетерогенности бноспецифического лиганда, нсполь-
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
273
&
I
г*
I
сэ
Ъ
с*
?
I
сэ
I
Рис. 10.10. Разделение химотрипсина мышей на сефарозе 4В, замещенной
различными препаратами соевого ингибитора трипсина [1].
1-Аш или pH; 2 - хкмотриптическая активность; 3-триптическая активность,
а - немо* днфицированный препарат Worthington ингибитор-сефароза,
присоединенный при pH 7.2; б -тот же препарат, модифицированный
химотрипснном; в - тот же препарат, что н на рис. б, но Присоединенный
при pH 8,5; г - химотрипснном модифицированный препарат Sigma ингибитор-
сефароза, присоединенный при pH 7,2.
зуемого для получения сорбента; 2) различных изменений лиганда под
влиянием иммобилизации; 3) различных изменений аффинного лиганда,
вызываемых молекулами, присутствующими в фракционируемой смеси.
Гетерогенность лиганда, используемого для иммобилизации
Высокомолекулярные аффинные лиганды биологической природы, такие, как
белки, нуклеиновые кислоты и углеводы, используемые для приготовления
специфического сорбента, могут быть генетически неоднородны; такая
гетерогенность может быть обнару-
274
Глава 10
жена и в продажных, и других препаратах лигандов. Очевидно, что
присутствие в иммобилизованных аффинных лигандах примесей, обладающих
таким же нли более сильным сродством к выделяемым молекулам, может
ухудшать полезность специфического сорбента при градиентных разделениях.
Изменения аффинного лиганда при иммобилизации
Эффективная активность лиганда под влиянием иммобилизации может меняться
самым различным образом. На взаимодействие иммобилизованного лиганда с
выделяемыми молекулами может оказывать значительное очень разнообразное
влияние микроокружение, образуемое матрицей (плотность заряда,
стерические препятствия и т. д.); оно же может также влиять и на
структуру аффинного лиганда. Иммобилизация приводит также к изменениям в
химической структуре, которые различным образом изменяют его молекулярные
свойства. Так, например, существенную роль играет число связей между
аффинным лигандом и нерастворимым носителем. Из сопоставления
результатов, представленных на рис. 10,10,6 и в, следует, что
неблагоприятное влияние возрастающего числа связей между молекулами
соевого ингибитора трипсина и сефарозой 4В вызвано увеличением pH с 7,2
до 15,5 во время связывания белка после активации бромцианом.
Изменения аффинного лиганда после иммобилизации
Фракционируемый материал может содержать компоненты, которые изменяют
активность присоединенного аффинного лиганда. Эти компоненты могут быть
близки выделяемым соединениям, хотя это и не обязательно. Ферменты,
например протеиназы и нуклеазы, присутствующие в неочищенных экстрактах,
могут расщеплять присоединенные аффинные лиганды (белки, нуклеиновые
кислоты) и тем самым уменьшать емкость сорбента для связывания
специфически комплементарного соединения. Кроме такой неспецифической
деградации аффинного лиганда ферменты и другие химические соединения,
присутствующие в фракционируемой смеси, могут специфически модифицировать
свойства присоединенного аффинного лиганда, приводя к образованию форм с
сохраненной, но измененной активностью.
На рис. 10.10 можно проследить все три отмеченных выше эффекта. Соевый
ингибитор трипсина, поставляемый фирмами Worthington Biochem. Со. и Sigma
был присоединен к сефарозе, активированной бромцианом. Присоединенный
ингибитор затем модифицировался раствором химотрипсина: колонка с
сорбентом промывалась раствором химотрипсина при pH 8 со скоростью потока
10 мл/ч в течение 24 ч и после инкубации химотрипсин элюировался буфером
с pH 2,5. Из рис. 10.10, а следует, что при использовании
немодифицированного препарата ингибитор (Worthington) -
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
275
Таблица 10.3
Условия элюирования химотрипсина I и химотрипсина Н мышей на
модифицированном химотрнпсином препарате ингибитор (Worthington)-
сефароза, иммобилизованном при pH 7,2
Количество поджелудочных желез,,взятых для получения экстрактов,
нанесенных на колонку Активность несвязавшегося химотрипсина, % pH
раствора химотрипсина
в пике I в'пнке II
0,5 0 4,75 4,30
