Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 110

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 198 >> Следующая

- глюкозо-6-фосфатдегндрогеназа; 4 - лактатдегндрогеназа; 5 - дрожжевая
алкогольдегидрогеназа,
Специфический комплекс выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным
лигандом может распадаться в результате пространственного
модифицирования, например, мочевиной, солями гуанидина или хаотропными
ионами. Эти реагенты разрушают водородные связи или изменяют структуру
воды вблизи гидрофобных областей. При использовании этих реагентов
следует помнить, что компоненты комплекса могут быть необратимо разрушены
при выделении. Однако известно, главным образом для иммобилизованных
ферментов, что присоединение белков к нерастворимым носителям приводит к
повышению стабильности. Подбирая концентрацию, температуру и время
обработки, можно конформационные изменения адсорбционных участков при
десорбции уменьшить до минимальных; то же самое относится и к обратимым
конформаци-онным изменениям молекул в целом как выделяемых веществ, так и
иммобилизованных аффинных лигандов. На практике следует предварительно
найти минимальную концентрацию, необходимую
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
271
для элюирования, определяя концентрацию и биологическую активность
элюатов. Например, элюирование 1,6 и 2 М гуанидинхло-ридом успешно
использовалось для выделения термолизина и суб-тилизииа соответственно
после их специфической сорбции на бен-зилоксикарбонил-Ь-
феннлаланилтриэтилентетраминил - сефарозе. Оба фермента в данных условиях
элюирования устойчивы; получены препараты с высокой удельной активностью
[11]. 6 М. гуа-
и 0,6 ?
02
Номер фракции.
Рис. 10.9. Аффинная хроматография РНК-полимеразы на ДНК-агарозе [29].
Колонка (150X10 мм) была уравновешена стандартным буферным раствором, в
котором проводилась хроматографий (0,01 М трис (pH 8,0), 10-3 М ЭДТА,
10"* М днтноэритротнол, 5%-ный глицерин], и 0,26 М хлоридом калия.
Элюирование адсорбированного белка осуществляли линейным градиентом
концентрации хлорида калия (€00 мл, 0.25-1,25 ноль/л) в стандартном
буферном растворе. 95 мл раствора РНК-полимеразы наносились на колонку.
Постоянная скорость потока при загрузке колонки и элюировании
поддерживалась перистальтическим насосом, Франции по 10 мл собраны и
испытаны на РНК-полнмераэрую активность с использованием ДНК тимуса
теленка (/) и ДНК Т4 (J2) в качестве матриц. Общий выход РНК.-
полнмеразной активности с колонки составлял 80%. Сплошная линия -
оптическая плотность при 280 нм, пунктир - концентрация хлорида калия.
нидинхлорид при pH 1,5 также успешно использован в качестве элюирующего
агента для элюирования лютеинизирующего гормона с колонки с агарозой с
иммобилизованной фракцией иммуноглобулиновых антител к лютеинизирующему
гормону [13]. Сразу же после элюирования pH раствора гормона доводился до
7,3 и проводился диализ раствора против 0,2 М бикарбоната аммония или
0,01 М. фосфатного буфера (pH 7,3), содержащего 0,9% хлорида иатрия.
Хилл [17] осуществил элюирование антител с иммуносорбентов с помощью
смесей диоксаиа со слабыми органичеокими кислотами. Использование сшитой
агарозы для приготовления иммобилизованного группового вещества крови А
позволило Кристиансену [23] применить для элюирования хаотропные ионы, а
именно роданид, трихлорацетат и трнфторацетат. Эффективность хаотроп-
272
Глава 10
ных ионов для десорбции с иммуносорбентов была показана также Беннихом и
Иохансоном [3]. В связи с элюированием антител интересно наблюдение Мерфи
и др. [27], касающееся увеличения аффинности антител при иммунизации.
Например, антитела против глюкагона можно эффективно элюировать с
иммуносорбента 4,25 М спиртом в 4 мМ. соляной кислоте, однако если они
были приготовлены из сыворотки того же кролика через 1 год, то для
элюирования следует использовать 0,1 М уксусную кислоту7, доведенную до
pH 2,2 муравьиной кислотой.
Использование растворов солей для элюирования выделяемых веществ с
сорбентов в гидрофобной хроматографии рассмотрено в разд. 7.1. Иеннисен и
Хейлмейер [20] показали, что элюирующая способность анионов соответствует
их расположению в ряду Гофмейстера и элюирующая способность катионов
обратна их высаливающему или всаливающему действию. Соли способны
проникать непосредственно между белком и гидрофобной поверхностью
сорбента, что приводит к десорбции белка. Если за адсорбцию ответственны
ионные взаимодействия, то элюирование белков должно зависеть от ионной
силы раствора, но не от природы и типов используемых солей. Общие аспекты
гидрофобной хроматографии, включая реагенты, применяемые для элюирования,
были рассмотрены Хьертеном [18].
.Если аффинный лиганд присоединен к матрице с помощью азосвязи или
сложноэфирными связями тиолов или спиртов, с нерастворимой матрицы можно
снять комплекс аффинного лиганда с выделяемым веществом, а затем аффинный
лиганд отделить диализом или гель-фильтрацией. Этот способ, однако, не
позволяет повторно использовать аффинную матрицу. Носители такого типа
детально обсуждены в разделе о ковалентной хроматографии (разд. 7.2).
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed