Структура и функции биологических мембран - Трошин А.С.
Скачать (прямая ссылка):
Для дезинтеграции хлоропластов механическим способом использовали метод Хьюджеса (Hughes, 1951), который для этих целей был применен впервые. Суспензию хлоропластов замораживали жидким азотом в специальной камере с отверстием и затем продавливали через это отверстие (диаметр около 1 мм). Исходное давление пресса составляло 200 атм.
Полученные фрагменты в первой серии экспериментов разделяли последовательным центрифугированием на YAK-60 на фракции по схеме: фрагменты, осаждавшиеся после]10 мин. центрифугирования при 1300 g — препарат Ф1, 3; осадок после 15 мин центрифугирования надсадочной жидкости Ф1, 3 при 20000 g — препарат Ф20; осадок после 30 мин. центрифугирования надосадочной жидкости Ф20 при 100000 g — препарат Ф100; осадок после 30 мин. центрифугирования надосадочной жидкости Ф100 при 145000 g — препарат Ф145.
Для лучшей очистки легких фрагментов схема I была модернизирована. Для этого удлинили время центрифугирования при получении препаратов Ф1,3 и Ф20 соответственно до 15 и 30 мин., затем ввели добавочное центрифугирование при 50000 (30 мин.) — препарат Ф50; а вслед за ним выделяли препараты Ф100, Ф145, и иногда Ф230 после 60 мин. центрифугирования соответствующих надосадочных жидкостей (II схема).
Ресуспендированные в буфере осадки, выравненные но содержанию хлорофилла, исследовали фотохимически и электронно-микроскопически. Определение активности и хлоропластов их фрагментов по фотовосстановлению НАДФ в присутствии искусственной системы доноров электронов и определение активности фотофосфорилирования с феназинментасульфатом (ФМС) (тесты на I фотосистему), а также определение фотовосстановления
х.----—---— ~ ттп ТТ ттплис\ттттттта ТТП ТТТтТШСЯМ. ПОИНЯТЫМ
ГЛАВА 8. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ МЕМБРАН 123
в отделе биохимии фотосинтеза Института физиологии растений АН УССР (Рейнгард и др., 1967, 1970; Островская, Кочубей, Рейнгардт, 1969). Активность АТФ-азы определяли по убыли неорганического фосфора из реакционной смеси, содержащей в 1,5 мл, кроме суспензии хлоропластов или их фрагментов: АТФ — 5 мкМ; MgCl2—2,5 мкМ; jra/шс-буфер — 30 мкМ; сахарозу — 240 мкМ.
Содержание хлорофилла в суспензиях определяли с использованием коэффициентов Вернона (Vernon, 1960).
Ультраструктура хлоропластов
Для исследования субмикроскопической организации основных структурных компонентов хлоропластов могут быть использованы различные методические подходы: с одной стороны, на целостной системе можно изучать хлоропласта клеток мезофилла некоторых растений (горох, кукуруза) с помощью метода ультратонких срезов, с другой — исследовать изолированные хлоропласта и их отдельные компоненты, полученные в результате применения различных фрагментирующих средств и выделения структурных элементов.
Первый методический подход позволяет изучить структуру хлоропласта и субструктуру фотосинтетических мембран, образующих тилакоиды гран и стромы. Исследование фрагментов с помощью метода негативного контрастирования дает возможность составить представление о форме, размерах и субструктуре изолированных тилакоидов гран и стромы и суб-хлоропластных частиц.
Анализ структуры хлоропластов высших растений, проведенный многочисленными исследователями, показал, что мембранная система этих органелл представлена оболочкой и фотосинтетическими мембранами, образующими два типа структурных компонентов — тилакоиды гран и тилакоиды стромы. На рис. 43 приведена электронная микрофотография ультратонкого среза хлоропласта, на которой отмечены мембраны, образующие тилакоиды гран и стромы.
Прежде чем перейти к анализу структурных элементов, образованных фотосинтетическими мембранами, необходимо остановиться на вопросах терминологии. Многообразие терминов, предложенных различными авторами для описания элементов фотосинтетического аппарата (ламеллы гран, двойные мембраны, межгранные связи, диски, пузырьки, фреты, канальцы, трубочки, тилакоиды гран и стромы и т. д.), мешает при интерпретации результатов исследования структурной организации хлоропластов. Многие из этих терминов устарели и не соответствуют современным представлениям. Проведя анализ большого числа микрофотографий и учитывая имеющиеся в литературе сведения (Фрей-Висслинг, Мюлеталер, 1968), можно считать, что в настоящее время к системе фотосинтетических мембран, обладающих весьма сложной субмикроскопической и макромолеку-лярной организацией, не целесообразно применять устаревший, появившийся в начальный период использования электронной микроскопии, термин «ламелла». Учитывая это, вместо термина «ламелла» мы будем использовать термин «фотосинтетическая мембрана».
Анализ изолированных мембранных элементов хлоропластов показал, что они представляют собой сплюснутые пузыри округлой или вытянутой
124 СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
Рис. 43. Система фотосинтетических мембран, образующих тилакоиды гран (тог) и тилакоиды стромы (тс) (ув. 108 ООО)
ГЛАВА 8. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ МЕМБРАН 125
формы (подробнее см. ниже). Эти структурные компоненты обладают внутренней полостью (локулой, см. рис. 44) и, следовательно, соответствуют термину «тилакоид», который был предложен Менке (Menke, 1961). Учитывая это, мембранные образования фотосинтетического аппарата следует называть тилакоидами гран или тилакоидами стромы, в зависимости от того, какой структурный элемент рассматривается в конкретном случае (рис. 43).
