Структура и функции биологических мембран - Трошин А.С.
Скачать (прямая ссылка):
Osborn MGander Parisi E., Carson J. 1972. J. Biol Chem., 247, 3962.
Pohl G. 1971. Biophysik, 7, 236.
Razin S. 1972. Biochim. et biophys. acta, 256, 241.
Razin S., Morowitz H., Terry T. 1965. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 54, 219.
Revel Ito S. 1967. In: The Specifity. New Jersey, p. 211.
Rotten S., Stein O., Razin S. 1968. Arch. Biochem. and Biophys., 125, 46.
Salyaeu R. [Саляев Р.]. 1968. Proc. IV Europ. Region. Conf. on Electron Microscopy, v. 2. Roma, p. 37.
Salyaev R., Tshernyshew W. [Саляев P., Чернышов В.]. 1972. Abstr. I Res. Conf. on Ion Transport across Membrantifei Berlin, p. 47.
Shimizu A. 1965. Sci. Repts (Japan), 14, 21.
Strugger S. 1926. Protoplasma, 7, 23.
Szubinska B. 1971. J. Cell Biol., 49, 747.
Takenaka Т., Inoue /., Ishima Y., Hidenori H. 1971. Proc. Japan Acad., 47, 554.
Yoneda М., Kamiya N. 1969. Plant and Cell Physiol., 10, 821.
Zahler P., Weibel E. 1970. Biochim. et biophys. acta, 219, 320.
Zwaal R., Deenen L. 1971. Biochem. J., 122, 62.
_>
ГЛАВА ВОСЬМАЯ
СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ МЕМБРАН
Исследованию организации фотосинтетических мембран, образующих структурные элементы хлоропластов на различных уровнях вплоть до молекулярного, посвящен целый ряд работ (Frey-Wissling, Stemmann, 1953; Calvin, 1962; Kreutz, Menke, 1962; Park, Pon, 1963; Miihlethaler et al., 1965; Шахов, 1969; Ширяев и др., 1969; Фрей-Висслинг, 1970). Однако еще многие детали архитектоники хлоропластов требуют тщательного изучения. Почти нет данных о тонкой структуре мембран, образующих оболочку хлоропласта и тилакоиды стромы. Проводятся лишь первые исследования субхлоропластных частиц и организации молекулярных агрегатов, соответствующих I и II фотосистемам (Воагшап, 1970; Ширяев и др., 1971; Островская и др., 1973). Начаты исследования по выяснению роли структурных элементов хлоропластов в осуществлении отдельных функций этих органоидов (Jacobi, Lehman, 1968; Sane et al., 1969, Островская, 1972; Ширяев и др., 1972).
Ограниченность сведений о субмикроскопической и макромолекуляр-ной организации фотосинтетических мембран мешает понять механизм деятельности фотосинтетического аппарата. Исследование структуры и функций хлоропластов на различных уровнях их организации необходимо для перехода к планомерной работе по реконструкции и моделированию мембранной системы фотосинтетического аппарата.
Прежде всего необходимо остановиться на ряде методических приемов исследования субмикроскопической и макромолекулярной организаций и функциональной роли структурных элементов, образованных мембранами хлоропластов.
Молодые (12—14 суток) растения гороха сорта Рамонский 77 и растения кукурузы гибрид Буковинский 3 (18—20 суток) выращивали в условиях вегетационного опыта в теплице или вегетационном домике на обычном черноземе с внесением фосфорных и калийных солей и азота.
Для изучения структуры хлоропластов отбирали кусочки ткани средней части листа. Фиксировали по Колфилду (Kolfield, 1957), и Лафту (Luft, 1956) с предварительной обработкой 6%-ным глютаральдегидом и без нее или по разработанной методике комбинированного (двойного) фиксирования (0s04 -f- КМп04). Образцы сначала фиксировали в 2%-ном растворе 0s04 на ацетат-мединаловом буфере с сахарозой в течение 4 час. на холоду. Затем их ополаскивали бидистиллятом и погружали на 20 мин. в 2,5%-ный раствор КМп04 на том же буфере. Последующие операции проводили по предложенной ранее прописи (Ширяев, 1969). Образ-
J
122 СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
цы заключали в метакрилатный предполимер, аралдит или эпон-812. Ультратонкие срезы изготовляли на ультрамикротоме УМТП-1.
При исследовании субмикроскопической и макромолекулярной структуры тилакоидов гран и стромы, их фрагментов и субчастиц использовали методы негативного и позитивного контрастирования 2%-ной фосфорновольфрамовой кислотой (ФВК) или уранилацетатом (УА). Ультратонкую формаваровую пленку готовили по Пизу (1963), микродырчатую колодие-во-углеродную — по Хаксли (Huxley, Zubay, 1961).
Структуру хлоропластов, изолированные из них элементы и субхлоро-_ пластные частицы изучали на электронных микроскопах JEM-7A и-JEM-100B.
Хлоропласты изолировали по описанной ранее методике (Рейнгард и др., 1967). В целях изучения локализации фотосистем и их разделения, а также выделения мембранных элементов и субхлоропластных частиц применяли физико-химический (инкубация с детергентами) способ дезинтеграции хлоропластов и механический (продавливание замороженных жидким азотом хлоропластов через очень малое отверстие при высоком давлении).
Дезинтеграцию хлоропластов детергентами осуществляли 15-минутным настаиванием на льду смеси равных объемов суспензии хлоропластов и 0,6%-ного раствора дигитонина или тритона Х-100 в том же буферном растворе, в котором выделялись хлоропласты. В отдельных опытах конечная концентрация детергента составляла 0,1—0,7%. В последней серии опытов к смеси суспензии хлоропластов и дигитонина добавляли 0,002 М ЭДТА и 0,01 М аскорбата натрия. Соотношение дигитонин: хлорофилл равнялось 3^: 1.
