Структура и функции биологических мембран - Трошин А.С.
Скачать (прямая ссылка):
После разработки метода фиксации и заливки препаратов в агар-ага-ровые микрокапсулы (Salyaev, 1968) появилась возможность прямого
ГЛАВА 7. ОСОБЕННОСТИ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ МЕМБРАН КЛЕТОК РАСТЕНИЙ Ш
изучения капель в электронном микроскопе. Для этой цели протоплазму получали из клеток нителлы, перерезаемых для предотвращения резкого выброса содержимого в миниатюрной декомпрессионной камере. Все операции выполнялись на установке, схематически показанной на рис. 35. (Чернышов, 1973). В установке для компенсации тургорного давления использовался принцип, изложенный в работе Куроды (Kuroda, 1964). При составлении раствора, который использовался для получения капель, учитывали рекомендации Шимицу (Shimizu, 1965). В большинстве случаев применяли раствор следующего состава: 0,05 М NaCl; 0,08 М КС1; 0,008 М Ca(N03)2, который был несколько гипотоничен по отношению
а»
Рис. 35. Установка для получения капель изолированной протоплазмы
1 — блок держателя микрокапсулы; 2 — блок декомпрессионной камеры; з — проволочный держатель; 4 — декомпрессионная камера; 5 — кювета с раствором; 6 — клетка; 7 — агаровая микрокапсула; s — манометр; 9 — резиновая груша
к клеточному соку. В этом растворе на вытекающей протоплазме сразу же формировалась прочная поверхность раздела. Размеры капель, полученных таким образом, колебались в пределах 50—300 мк. Сформированные капли протоплазмы улавливались в агар-агаровые микрокапсулы, в которых проводили фиксацию, обезвоживание и заливку в эпоксидные смолы.
Процесс получения и улавливания капель в микрокапсулу заключался в следующем. Клетки междоузлия хары или нителлы помещали на 2/3 ее Длины в декомпрессионную камеру и изолировали от окружающей среды вакУУмной замазкой. Затем декомпрессионная камера вместе с клеткой опускалась в кювету с раствором. Под нижний конец клетки подводили агаровую микрокапсулу1 на проволочном держателе. В декопресси-°нной камере создавалось небольшое разряжение (около 20 мм рт. ст ), после чего нижний конец клетки срезали маленькими ножницами. Когда капля сформировалась, она отрывалась и падала в микрокапсулу. Всю установку расположили таким образом, чтобы и клетка, и капсула с держателем были в поле зрения бинокулярной лупы МБС-2, поставлен-
1 Изготовление агаровых микрокансул подробно описано в работе Заляева (Salyaev,
112 СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
Рис 36 Получение капель изолированной протоплазмы
а — улавливание капли в агаровую микрокапсулу, б — капля протоплазмы в световом микроскопе Рис 37 Ультраструктура капли
а — внутренняя зона я — ядро, м — митохондрии, ос — осмиофильные тела, э — эндоплазмати-— вттттапа'и rrmt.TiwiT- .— ттппрпуттпрть м м. — ттгпаничная мембтэана сттэелкой ука
ГЛАВА 7. ОСОБЕННОСТИ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ МЕМБРАН КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ИЗ
ной горизонтально. Процесс истечения протоплазмы и формирование капель легко контролируются визуально при увеличениях в 20—40 раз. На рис. 36, а показано истечение протоплазмы из перерезанной клетки в микрокапсулу. В нижней части микрокапсулы видна готовая капля шаровидной формы. Данная методика удобна тем, что очень легко оперировать каплей, находящейся в микрокапсуле. Она не уносится конвекционными потоками жидкости и надежно защищена от механических повреждений. Если капля прочно присоединяется к стенке или дну капсулы, то последнюю можно не запаивать сверху; капля не вымывается при переносе капсулы в фиксирующие смеси. Если же капля не прикреп-
лена и лежит в капсуле свободно, то верхний открытый конец капсулы запаивается агар-агаром. В этом случае тонкие агар-агаровые стенки капсулы не являются препятствием для диффузии фиксирующих и обезвоживающих смесей. Следует отметить, что стенки капсулы прозрачны и не мешают наблюдать за каплей в оптический микроскоп при разных увеличениях. На рис. 36 показана капля протоплазмы при относительно большом увеличении, видны зернистое содержимое и четкая поверхность раздела.
Для электронно-микроскопических исследований фиксация изолированных капель проводилась в течение 1 часа в 1,5%-ном глутаровом альдегиде, доведенном 0,1 М фосфатным буфером до pH 7,2—7,4. После альдегидной фиксации материал дополнительно фиксировался 1 час в 1% четырехокиси осмия, приготовленной на том же буфере. Заливка проводилась по обычной методике в ЭПОН — 812 и в отдельных случаях в бутилметакрилат. Ультратонкие срезы контрастировали по Рейнольдсу и изучали в электронных микроскопах УЭМВ-100 и JEM-7A.
Электронно-микроскопическими исследованиями было установлено, что приведенный выше метод препарирования капель обеспечивает вполне удовлетворительную сохранность всех компонентов ультраструктуры: эндоплазматической сети, рибосом, ядер, митохондрий, аппарата Гольджи, пероксисом, осмиофильных тел, но гиалоплазма выглядит несколько более разжиженной, очевидно, вследствие некоторой гипотоничности окружающей среды. На рис. 37, а представлено в общем виде содержимое капли под электронным микроскопом. Рис. 37 б показывает, что поверхность капли сформирована сплошной мембраной толщиной около 100 А, которая морфологически весьма близка к мембранам внутренних структур. На основе этих данных был сделан вывод о том, что на поверхности изолированной протоплазмы действительно формируется мембрана, а не слой геля, образующийся в результате поверхностной преципитации (Саля-ев, Чернышов, 1971; Salyaev, Tshernyshow, 1972). На отдельных снимках видно трехслойное строение этой мембраны, свойственное для ряда биологических мембран. На рис. 38 приведены микроденситограммы
