Структура и функции биологических мембран - Трошин А.С.
Скачать (прямая ссылка):
В первых работах по субстратному регулированию мембранного гидролиза в простых модельных опытах был изучен гидролиз определенных субстратов в присутствии различных модификаторов. При этом, в част-
292
МЕМБРАНЫ ВСАСЫВАЮЩИХ КЛЕТОК
ности, обнаружено, что трибутирин является ингибитором у-амилазной, глицил-1-лейциндипептидазной и щелочнофосфатазной активностей тонкой кишки крыс. Торможение в зависимости от условий экспериментов варьировало в пределах 50—75%. В ходе дальнейшего исследования регуляторных свойств щелочной фосфатазы показано, что величина торможения активности трибутирином и глицил-1-лейцином практически не меняются после солюбилизации фермента тритоном Х-100 (Уголев, 1972; Уголев и др., 1974).
Таким образом, приведенные данные позволяют думать, что, поскольку модификаторные эффекты в значительной степени или полностью сохра
Рис. 110. Влияние адреналина на инвертазную активность изолированных энтероцитов (а), их гомогенатов (б) и солюбилизированных ферментов (в)
Рис. 111. Влияние трибутирина на гидролиз растворимого крахмала у-амилазой тонкоt кишки крыс
1 — гидролиз растворимого крахмала; 2 — то же в присутствии трибутирина (0,25%); I — солюбилизация тритоном Х-100; II — солюбилизация трипсином
Рис. 112. Влияние тепловой обработки (56 0 в течение 60 мин.) на торможение у~ами_ лазной активности мальтозой
1 — гидролиз растворимого крахмала; 2 — то же в присутствии мальтозы (0,28 М)
няются после солюбилизации, они осуществляются, по-видимому, в пределах ферментных глобул, локализованных на внешней поверхности мембран энтероцитов (Уголев, 1972).
Поэтому дальнейшие результаты экспериментов по влиянию трибутирина на у-амилазную активность очищенного препарата фермента явились неожиданными, так как было обнаружено отсутствие тормозных влияний трибутирина на фермент. Кроме того, было установлено, что после отделения фермента от мембраны модификаторные эффекты зависят от способа солюбилизации: после обработки гомогената слизистой тонкой кишки тритоном Х-100 торможение трибутирином частично сохраняется и составляет 13—22,6% (после 15 и 30 мин. инкубации соответственно). Вместе с тем трибутирин практически не влияет на фермент, солюбилизированный трипсином (рис. 111).
мин
ГЛАВА 16. МЕМБРАННОЕ ПИЩЕВАРЕНИЕ
293
Таким образом, после солюбилизации протеазой фермент полностью утрачивает чувствительность к модификатору, в то время как после солюбилизации детергентом способность фермента к регулированию трибути-рином частично сохраняется.
Эти данные представляют интерес также в связи с упоминавшимися исследованиями щелочной фосфатазы, когда было обнаружено, что регуляторные свойства присущи солюбилизированным ферментам, однако они отличны от таковых для ферментов, связанных с мембраной, и зависят от способа солюбилизации. Оказалось,что солюбилизация тритоном Х-100 не изменяет тормозных эффектов трибутирина и глицил-1-лейцина на щелочнофосфатазную активность, в то время как солюбилизация протеазой (папаином) вызывает уменьшение степени торможения этими модификаторами (Уголев, 1972; Уголев и др., 1974).
В других экспериментах по субстратному регулированию изучалось влияние мальтозы на у-амилазную активность очищенного препарата фермента. Подобно другим исследователям (Eggermont, 1968; Seetharam et al., 1970), мы наблюдали торможение активности фермента в присутствии мальтозы, которое составляло 76—93%. Первоначально было сделано предположение, что в силу структурного сходства субстрата и модификатора мальтоза тормозит у-амилазную активность изостерически. Этому мнению способствовали также данные Эггермона (Eggermont,
1968), на основании которых автор интерпретирует конкурентное ингибирование мальтозой как изостерическое. Однако при использовании десенсибилизации (мягкой температурной обработки препарата фермента в течение 1 часа) был получен неожиданный эффект: десенсибилизация приводила к частичной потере чувствительности у-амилазы к тормозному действию мальтозы. Как видно из рис. 112, после часовой тепловой обработки фермента торможение мальтозой снижается до 35,3 и 20% (после 15 и 30 мин. инкубации соответственно) по сравнению с 93,2 и 76% (после таких же сроков инкубации) торможения ненагретого контроля.
Таким образом, выше представлены данные о влиянии структурирования различных (в том числе пищеварительных) ферментов на их каталитические и регуляторные свойства.
Влияние свойств носителя на свойства структурированных ферментов. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что природа носителя, с которым связывается фермент, во многом определяет свойства комплекса фермент — носитель. Например, при изучении а- и (3-амилаз было высказано предположение (Barker et al., 1968, 1971), что гидрофильная природа носителя способствует возрастанию устойчивости прикрепленных ферментов, в то время как гидрофобные свойства носителя оказывают противоположное влияние.
В зависимости от свойств носителя может наблюдаться как активация, так и инактивация ферментов или отсутствие изменений их активности. Показано, что химотрипсин активируется при связывании с КМ-целлю-лозой (Mitz, Summaria, 1961) и с ДНК, в то время как после связывания с сефадексом Г-200 он почти полностью инактивируется (Axen, Porath, 1966). Трипсин активируется при образовании комплекса с КМ-целлю-лозой (Mitz, Summaria, 1961) и при адсорбции на липидных эмульсиях и лишь частично сохраняет активность при связывании с сефадексом (Axen, Porath, 1966) и с эфирами целлюлозы (Суринов, Манойлов, 1966). Активность папаина, связанного с сополимером нитрированного 4-фтор-
