Структура и функции биологических мембран - Трошин А.С.
Скачать (прямая ссылка):
ГЛАВА 13. ФОТОРЕЦЕПТОРНЫЕ МЕМБРАНЫ
227
ром неких последующих реакций, приводящих к формированию зрительного сигнала.
Все эти стадии были показаны также при комнатной температуре методом флеш-фотолиза (Wulf et al., 1958; Grellmann et al., 1962; Pratt et al., 1964; Williams, 1970; Bruch et al., 1972).
При температуре выше 0° протекают конечные стадии фотолиза родопсина. Вопрос о последовательности и природе конечных продуктов фотолиза вызвал активную дискуссию: существовали разногласия о роли и месте метародопсина 4в5Ш. Окончательный ответ на этот вопрос был получен при работе с целой сетчаткой лягушки (Kemp, 1972; Baumann, Rein-heimer, 1972); метародопсин III был обнаружен при фотолизе, однако его количество не превышало 50% от количества выцветшего родопсина. Следовательно, распад метародопсина II может идти двумя путями: 1) образование метародопсина III и затем его распад, 2) прямой гидролиз метародопсина II.
Существенным отличием фотолиза родопсина в мембранах от такового в экстрактах, вероятно, является конечный продукт: в сетчатке образуется полностью траис-ретинол, а в экстрактах и «старых» препаратах палочек — полностью траис-ретиналь. Восстановление ретиналя осуществляется с помощью фермента ретинальдегидрогеназы, который был подробно изучен в серии работ (De Pont et al., 1970; Rotmans, 1973). Судя по этим работам, это — второй (помимо родопсина) белок, локализация которого в фоторецепторной мембране не вызывает сомнения.
Однако, несмотря на сходство спектров поглощения промежуточных реакций фотолиза родопсина, кинетические параметры: величины энергии активации, свободной энергии и энтальпии, полученные при исследовании на сетчатке ив экстракте, существенно отличаются. Было показано, что в сетчатке значительные изменения этих параметров происходят только на стадии гидролиза метародопсина II (Baumann, Reinheimer, 1973).
Какие же изменения происходят с фоторецепторной мембраной при фотолизе родопсина? При рассмотрении этого вопроса мы позволим себе более подробно остановиться на результатах, полученных в последнее время в лаборатории физико-химических основ рецепции Института химической физики АН СССР.
Обычными методами электронной микроскопии не удалось выявить никаких фотоиндуцированных изменений этой мембраны (Боровягин и др., 1971). В то же время методом замораживания — травления было показано небольшое изменение внутренней гидрофильной и гидрофобных поверхностей (Mason et al., 1972). В последнее время методом рентгеноструктурного анализа удалось обнаружить после выцветания небольшое изменение профиля в гидрофобной области (Corless, 1972). Согласно некоторым представлениям (Blasie, 1972), глобулы родопсина в основном находятся в гидрофильной фазе мембраны (28 А) и только частично погружены в липидный слой (14 А). Обесцвечивание сопровождается погружением молекулы родопсина в липидный слой на 7 А, при этом в гидрофильной области остается 21 А, а в гидрофобной — тоже 21 А глобулы родопсина.
При освещении наружного сегмента плоскополяризованным светом было показано, что положение хромофора при фотолизе родопсина вплоть до стадии метародопсин II не меняется, т. е. ретиналь остается ориентированным перпендикулярно длинной оси наружного сегмента. Только
228
МЕМБРАНЫ НЕЙРОНОВ, РЕЦЕПТОРНЫХ КЛЕТОК И СИНАПСОВ
ретинол, отделенный от опсина и растворенный в липидной фазе, рас-" положен параллельно длинной оси палочки. При освещении в присутствии гидроксиламина конечным продуктом фотолиза является ретиналь-оксим. Он ориентирован так же, как и ретинол, параллельно длинной оси палочки (Kemp, 1972).
Выцветание родопсина как в экстракте, так, по-видимому, и в сетчатке сопровождается увеличением количества SH-групп, способных выяв= ляться титрованием. В целой гомогенизированной сетчатке в темноте было найдено 2,95 -1017 SH-групп, а после освещения — 9,03 -1017 SH-rpynn на сетчатку (Buckser, McGee, 1971).
Особое внимание привлекает вопрос о конформационных изменениях белковой части родопсина. Уже в первых работах по фотолизу родопсина в экстрактах был сделан вывод о том, что выцветание имеет некоторые черты денатурации. Однако такой вывод плохо согласовывается с известными опытами по регенерации родопсина: добавление ll-ifuc-ретиналя к обесцвеченному родопсину приводит к его спонтанной регенерации и эта реакция не требует энергии. Такая реакция наблюдается как в экстрактах, так и в суспензии, и регенерированный родопсин ничем не отличается от исходного, т. е. на конечной стадии фотолиза конформация опсина должна быть идентичной конформации опсиновой половины родопсина. В настоящее время появилось много новых методов исследования, которые позволяют разрешить вопрос о наличии и характере конформационных изменений при фотолизе родопсина. Весьма перспективным является изучение спектров дисперсии оптического вращения или кругового дихроизма в области поглощения белка. На экстрактах родопсина в жестких детергентах (ЦТАБ или эмульфоген) обнаружены значительные изменения спектра кругового дихроизма в области 230 нм, свидетельствующие о значительной конформационной перестройке его белковой' части (рис. 84) (Федорович, 1968, 1973; Shichi, 1971). Согласно этим данным, в родопсине, экстрагированном эмульфогеном, около 60% белка спирализо-вано, а обесцвечивание приводит к деспирализации около трети спирали-зованных участков. Эти значительные конформационные изменения сопоставимы с тем, что происходит при денатурации родопсина под действием тепла или мочевины. Естественно, что в этих детергентах после обесцвечивания родопсин не способен к регенерации. На дигитониновых экстрактах родопсина, в которых, судя по всему, зрительные пигменты остаются наиболее нативными (Боровягин и др., 1971), и на родопсиновых частицах, полученных после дезинтеграции наружных сегментов ультразвуком, никаких фотоиндуцированных изменений кругового дихроизма в УФ области обнаружить не удалось (рис. 85) (Федорович, 1968, 1972; Shichi, 1971). Провести аналогичное исследование на суспензии наружных сегментов или целой сетчатке, к сожалению, невозможно, так как светорассеяние мешает измерению. Однако в данном случае дигитониновые экстракты и ро-допсиновые частицы, по-видимому, являются адекватной моделью фоторецепторной мембраны in vivo. Изменения кругового дихроизма в родопсиновых частицах наблюдаются только после обесцвечивания предварительно делипидизированных препаратов. Очевидно, фотоиндуцированная денатурация, найденная в жестких детергентах, также обусловлена нарушением белок-липидных взаимодействий в процессе экстракции, что указывает на важную роль липидов в сохранении нативности фоторецепторной мембраны и родопсина и на их тесную связь с родопсином.
