Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Третьяков Н.Н. -> "Практикум по физиологии растений" -> 71

Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.

Третьяков Н.Н. Практикум по физиологии растений — М.: Агропромиздат, 1990. — 271 c.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка): praktikumpofiziologii1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 65 66 67 68 69 70 < 71 > 72 73 74 75 76 77 .. 102 >> Следующая

Порядок работы. Выделение амилаз. Взвешивают 4 г проросших семян пшеницы, ячменя или гороха, помещают в фарфоровую ступку, добавляют немного промытого и прокаленного кварцевого песку, 10 мл
1 %-го раствора NaCl и тщательно растирают до получения однообразной мелкодисперсной кашицы. Добавляют еще 5 мл раствора NaCl и продолжают растирание.
Затем смазывают нижнюю часть носика ступки вазелином и суспензию количественно переносят в центрифужную пробирку на 50 мл. Ступку и пестик несколько раз ополаскивают небольшими порциями раствора NaCl, следя за тем, чтобы объем суспензии в пробирке не превысил 40.. .45 мл. В пробирку помещают стеклянную палочку и содержимое тщательно перемешивают, после чего оставляют на 1 ч в холодильнике (каждые 15 мин перемешивают). Затем пробирку вынимают из холодильника, вытаскивают стеклянную палочку, все пробирки с исследуемыми ферментными препаратами уравновешивают между собой, помещают в гнезда ротатора центрифуги и центрифугируют в течение 15 мин. Надосадочную жидкость (препарат амилаз) осторожно сливают в чистую сухую колбу, закрывают и при необходимости помещают в холодильник.
Приготовление субстрата. Активность амилаз, выделенных из того или иного растительного объекта, определяют при помощи специально приготовленных растворов чистого крахмала заданной концентрации. В две градуированные на 10 мл чистые сухие пробирки вносят по 3 мл 0,2 и. ацетатного буфера с pH 5,5 и по 3 мл 2 %-го раствора крахмала. При серийных определениях пробирки, заполненные забуфсренным раствором крахмала, можно заготовить сразу на всю серию. Осторожным легким встряхиванием содержимое пробирок перемешивают.
Заготовленные пробирки ставят на водяную баню, заранее нагретую до 40 °С. По достижении 'субстратом температуры бани (проверяют по контрольной пробирке, в которую вставлен термометр) в пробирки приливают по 0,5 мл ферментного препарата, смесь осторожно перемешивают. В серии обязательно должна быть контрольная пробирка, которая содержит все те компоненты, что и остальные, но вместо препарата ферментов в нее вносят 0,5 мл воды. Пробирки вновь помещают на 30 мин на водяную башо, нагретую до 40 °С.
Если есть термостат, пробирки с реакционной смесыо лучше поместить в него. Через 30 мин инкубирования в реакционную смесь каждой пробирки для остановки реакции вносят по 2 мл 1 н. раствора НС1, содержимое их перемешивают. Затем из каждой пробирки берут по 0,5 мл смеси и вносят в мерные колбы на 50 мл, которые заранее до половины заполнены водой и в них
внесено по 1 мл 0,1 н. раствора НС! и по 5 капель 0,3 %-го раствора йода в 3 %-м растворе KI. Колбы доводят до метки водой, закрывают и хорошо перемешивают содержимое.
Окрашивание смеси лучше проводить во времени с интервалами 3 мин, стремясь к тому, чтобы период от начала окрашивания до спектрофотометрирования (колориметрирования) для каждой колбы был примерно одинаковым (в среднем 3 мин). Спектрофотометри-рование окрашенных растворов выполняют при 595 нм (фотозлектроколориметрирование — яри красном светофильтре) .
Активность амилаз '(в 1 мг гидролизованиого крахмала за 1 ч на 1 мл ферментативного раствора) рассчитывают по формуле
Ек—Ео 2-2
АА=--------------.
Ек 60
где Ек и Е0 — светопоглощеиие контрольного и опытного растворов, единиц шкалы прибора; 2 и 2 — пересчетпые коэффициенты на 1 ч и 1 мл ферментного раствора; 60 — пересчетный коэффициент на 1 мг крахмала (3 мл и 2% -го раствора соответствуют 60 мг).
Полученные данные записывают по форме (табл. 55).
55. Определение активности амилазы (АА)
Номер Объект Навеска Объем Объем ?в,1В АА
пробирки исследо материала, препарата раствора
вания г амилаз, субстрата,
мл мл
1
2
3
4
Материалы и оборудование. Проросшие семена пшеницы, ячменя и гороха, 1 %-й раствор NaCl; 0,2 н. ацетатный буфер с pH 5,5; 2%-й раствор крахмала; 1 н. раствор HCI, 0,1 и. раствор НС1.
Фарфоровые ступки с пестиками, кварцевый песок; центрифужные пробирки на 50 мл; градуированные пробирки па 10 мл; мерные цилиндры на 25 мл; градуированные пипетки па 1 и 5 мл; аналитические и лабораторные весы; водяная баня или термостат; мерные колбы на 50 мл; конические колбы па 100 мл; цептрпфуга; спектрофотометр (СФ-26, «Спекол», ФЭК-60); фотоэлектроколориметр (ФЭК-56М).
Работа 68. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЖИРОВ РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Вводные пояснения. Жиры выполняют функцию запасных высокоэнергетических веществ, откладывающихся в плодах и семенах. Они представляют собой смесь сложных эфиров глицерина и высокомолекулярных жирных кислот.
При прорастании семян одна часть запасных жиров используется на дыхание, а другая — в реакциях обмена веществ превращается в углеводы и передвигается к точкам роста. Снижение содержания жиров в зародыше, эндосперме и семядолях сопровождается и изменением состава свободных жирных кислот. Превращение жиров идет в присутствии ферментов, активность которых увеличивается при прорастании семян. Повышение активности липазы по мере прорастания семян обеспечивает гидролиз триглицеридов до диглицеридов, моноглицеридов, а затем до жирных кислот и глицерина.
Предыдущая << 1 .. 65 66 67 68 69 70 < 71 > 72 73 74 75 76 77 .. 102 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed