Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка):
Осаждение крахмала из раствора. Две порции фильтрата объемом по 5 мл каждая помещают в центрифужные пробирки на 10 мл. В каждую из пробирок вносят по 2 мл 0,5 %-го раствора йода в йодиде калия, содержимое перемешивают - стеклянной палочкой и пробирки оставляют при комнатной температуре на 30 мин. За это время выпадает осадок, который представляет собой комплекс крахмала и йода. Следующая операция —омывание осадка. Из пробирок вынимают стеклянные палочки, пробирки уравновешивают между собой, помещают в центрифугу и центрифугируют в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок еще три раза промывают 5 %-м раствором Ca(NOs)25 добавляя его по 5 мл и взмучивая после этого осадок стеклянной палочкой. Надосадочную жидкость после каждого центрифугирования отбрасывают.
Окисление комплекса крахмал — йод. Промытые осадки комплекса крахмала с йодом количественно переносят в конические колбы на 200 мл, каждый раз омывая пробирки небольшим количеством воды.
Объем водной суспензии в конической колбе не должен превышать 3 мл. Затем в каждую колбу приливают по 10 мл 0,25 и. раствора К2Сг207, растворен-' ного в 85 %-м растворе серной кислоты, содержимое колб перемешивают и сразу помещают на кипящую водяную баню на 15 мин для окисления комплекса.
Разрушение избытка б и хромата калия. Через 15 мин колбы снимают с бани и охлаждают, затем наливают в каждую по 5 мл 20 %-го раствора KI
и 120 мл воды и осторожно перемешивают. В результате разложения бихромата в раствор выделяется йод.
Титрование йода. Выделившийся йод оттитро-вывают 0,1 н. раствором тиосульфата натрия (гипосульфита). Титровать лучше с использованием магнитной мешалки. Скорость добавления раствора тиосульфата натрия — 25.. .30 капель в 1 мин. Сначала титрование ведут до появления желтой окраски, затем в колбы приливают по 1 мл 0,5 %-го раствора крахмала и титруют до перехода интенсивной сине-голубой окраски в бледно-голубую. При расчете учитывают, что 1 мл 0,1 н. раствора тиосульфата натрия соответствует 0,675 мг крахмала.
Проводят контрольное определение количества тиосульфата натрия, затрачиваемого иа связывание йода, который выделяется в период разрушения бихромата калия. Для этого в коническую колбу на 200 мл наливают 120 мл воды, 10 мл 0,25 н. раствора К2СГ2О7 и 5 мл 20 %-го раствора KI. В колбу опускают якорь магнитной мешалки, содержимое перемешивают и титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия, как и исследуемые растворы. Содержание крахмала в исследуемом образце, %, рассчитывают по формуле
^__ 0,675-I/r(a-a,)U)0
_. _
где а и щ — объем 0,1 п. раствора тиосульфата натрия, затраченного иа титрование контрольного и исследуемого растворов, мл; V — объем раствора, в котором растворена навеска исследуемого объекта, мл; V\ — объем раствора, взятого для осаждения крахмала, мл; Т — поправка к титру 0,1 п. раствора тиосульфата натрия; Я—навеска растительного материала, г.
54. Определение содержания крахмала
Навес Исходный Объем
экстракта,
Номер Объект ка ма экстракта взятый
колбы иссле териала крахмала для осаж
довании (Я-). (V), дения
г крахмала
(1Л)> мл
Израсходовано раствора тиосульфата натрия, мл
i,a конт на иссле
рольный дуемый
образец образец
(я) («0
Содер-
жание
крах-
мала
(С),
1
2
3
4
Результаты записывают по форме (табл. 54).
Материалы и оборудование. Семена пшеницы, ячменя и^гороха (фасоли), отобранные на разных стадиях спелости; 80 %-й раствор Ca(N03)2; 0,5 %-й раствор йода в 1<1; 5 %-й раствор Ca(N03)2; 0,25 н. раствор К2СГ2О7 в 85 %-м растворе H2SO4; 20 %-й раствор КД; ОД н. раствор Na2S203; 0,5 %-й раствор крахмала; кварцевый песок.
Аналитические весы, фарфоровые ступки с пестиками, конические колбы на 150 и 200 мл, маленькие фильтровальные воронки, электроплитка с закрытой спиралью и терморегулятором, мерные колбы на 100 мл, фильтры (белая лента), воронки для фильтрования; пипетки на 5 мл с делениями, стеклянные палочки, центрифужные пробирки на 10 мл, мерные цилиндры на 25 и 100 мл, водяная баня, магнитная мешалка, центрифуга.
Работа 67. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗ В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ
Вводные пояснения. В процессе прорастания семян в результате гидролиза и фосфоролиза крахмал распадается на более простые соединения. Гидролитический распад запасного крахмала может протекать при участии четырех видов гидролаз: а-амилазы, (3-амилазы, глюкоамилазы и амилопектин-1,6-глюкозидазы. Фосфо-ролитический распад запасного крахмала осуществляется ферментом а-глюканфосфорилазой. По мере набухания сухих семян в период прорастания возрастает активность гидролитических ферментов, при этом содержание крахмала падает, а сахаров возрастает.
Определение суммарной активности амилаз включает выделение амилаз раствором NaCl, инкубацию их со стандартным раствором крахмала в течение заданного промежутка времени и, наконец, колориметрическое определение негидролизованного амилазами остаточного крахмала. Активность амилаз выражается в миллиграммах гидролизованного крахмала за 1 ч на 1 мл раствора ферментов или в миллиграммах гидролизо-ваиного крахмала на 1 мг белка за 1 ч (удельная активность) .
