Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка):
1...2 мин добавляют по 2 мл ферментативного препарата, встряхивают и вслед за этим в каждую приливают по 4 мл 10 %-го раствора ТХУК. Все остальные операции проводят, как и в опытных вариантах.
Пробирки с опытными растворами встряхивают и оставляют иа водяной бане еще 30 мин для более полного осаждения иеирореагировавших с протеиназами белков и самих ферментов. Пробирки снимают с водяной бани, осторожно насухо вытирают и уравновешивают на рычажных лабораторных весах, добавляя при необходимости в более легкие несколько капель 5 %-го раствора ТХУК. Затем пробирки помещают в ротатор центрифуги, центрифугируют 15 мин, ставят в штатив и приступают к спектрофотометрированию надосадочной жидкости. Параллельно определяют содержание белков в кол-
-бе, где находится ферментный препарат (так же, как ¦суммарные белки в растительном материале). В качестве эталонного раствора берут дистиллированную воду.
Пример 4, В кварцевую кювету спектрофотометра наливают 2/з объема надосадочной жидкости контрольного образца и ставят в гнездо 1 юоветодержателя. В гнезда 2, 3 и 4 помещают кюветы 'С исследуемыми растворами. Следят, чтобы не произошло путаницы, и если субстратом служил раствор гемоглобина с заданным pH, то при расчетах учитывают светопоглощеиие этого же раствора (контроль). Кюветодержатель помещают в кюветпую камеру, закрывают крышку и делают отсчеты по шкале прибора светопогло-щения (Е) всех растворов поочередно при 280 нм.
Данные записывают по форме (табл. 53).
53. Определение активности протеиназ
Объест Активность
иссле протеиназ
'Номер Субстрат Еш едшшц единиц
опыта АП га 1 мг АП на 1 мг
белка за па пески
1 ч за 1 ч
Контрол!.
Контроль
Казеин, pH 8 Гемоглобин, pH 6 Гемоглобин, pH 3
Казеин, pH 8 Гемоглобин, pH 6 Гемоглобин, pH 3
Казеин, pH 8 Гемоглобин, pH 6 Гемоглобин, pH 3
Казеин, pH 8 Гемоглобин, pH 6 Гемоглобин, pH 3
Активность протеиназ в условных единицах на 1 г навески за 1 ч или в условных единицах на 1 мг белка за 1 ч рассчитывают по формуле
АП = &,
Л] (или Б|)
где Е„ и Ео — светопоглощеиие контрольного и опытного образцов; j4i—навеска материала, соответствующая количеству фор-
( А-2
ментного препарата, взятого для определения Ах=___________ , где Л —
> г, 50
навеска материала, взятая для анализа, г), г; Вл — содержание
/ _ 5-2-1000 ^
белка в препарате Б{=----------г где 5—навеска казенна или
¦ 100
гемоглобина, г), мг; 2 — коэффициент пересчета на 1 ч.
Материалы и оборудование. Проросшие семена гороха, фасоли, пшеницы или ржи, казеин, гемоглобин, 0,2 М фосфатный буфер с pH 8, Vis М фосфатный буфер с pH 6; растворы 0,3 и. НО, 1 и. NaOH, 5 %-й и 10 %-й ТХУК, 1 н. НС1; мочевина.
Фарфоровые ступки с пестиками, вороики для сыпучих веществ, мерные колбы на 50 и 100 мл, пипетки с делениями на I и 5 мл, центрифужные пробирки на 20 мл, ротатор, центрифуга, спектрофотометр СФ-26 (СФ-16, СФ-4).
Работа 66. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАПАСНОГО КРАХМАЛА В СЕМЕНАХ ПО ПОЧИНКУ
Вводные пояснения. В семенах и плодах многих сельскохозяйственных культур углеводы в основном запасаются в виде крахмала. Крахмал—полисахарид, состоящий из амилазы и амилопсктина, которые также являются полисахаридами, но обладают меньшей молекулярной массой и отличаются друг от друга по физическим и химическим свойствам.
Объемный метод по Починку включает следующие операции: экстракцию крахмала; осаждение крахмала в виде комплексного соединения с йодом; окисление комплекса бихроматом калия в кислой среде (при этом выделяется углекислый газ и вода); разрушение избытка бихромата калия раствором KI (в качестве одного из продуктов реакции выделяется йод); титрование йода гипосульфитом натрия. Содержание крахмала рассчитывают по количеству затраченного при титровании гипосульфита натрия.
Порядок работы. Экстракция крахмала и з растительного материала. На аналитических весах взвешивают 30,0 мг высушенных зерновок пшеницы или семядолей гороха, отобранных в различные периоды их формирования, помещают в фарфоровую ступку, приливают 5 мл 80 %-го раствора Са(ЫОз)а 11 тщательно растирают. Если материал растирается плохо, добавляют немного прокаленного кварцевого песку. В среднем на операцию растирания навески затрачивают 8.. .10 мин. После этого содержимое ступки количественно переносят в коническую колбу иа 150 мл, обмывая каждый раз небольшими порциями ступку и пестик. Необходимо следить за тем, чтобы объем экст-
ракта в колбе не превышал 30 мл. Затем ее накрывают маленькой воронкой, ставят на электроплитку с закрытой спиралью, снабженную терморегулятором, и не очень сильно кипятят в течение 3 мин. Затем колбу снимают с плитки и оставляют при комнатной температуре для охлаждения. После этого экстракт крахмала количественно переносят в мерную колбу на 100 мл, а коническую колбу несколько раз ополаскивают 80 %-м раствором Ca(N03h, каждый раз сливая промывной раствор в мерную' колбу. Затем содержимое мерной колбы доводят до метки этим же раствором, плотно закрывают и несколько раз перемешивают. Перед следующей операцией раствор крахмала фильтруют через складчатый фильтр (белая лента).
