Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка):
Порядок работы. Подготовительные операции. Выделение протеиназ. Взвешивают 4.. .5 г сырых семядолей или зерновок (навеска сухого материала около 1 г), помещают в ступку, добавляют немного кварцевого песку и тщательно растирают. Приливают 5 мл дистиллированной воды и продолжают растирание до получения мелкодисперсной гомогенной кашицы. Навеску количественно переносят в мерную колбу на 50 мл, ополаскивая пестик и ступку небольшими порциями воды. Объем жидкости в колбе доводят до 50 мл, суспензию перемешивают и оставляют настаиваться в течение 1 ч (периодически перемешивая) при 2.. .5 °С.
Затем содержимое колбы переносят в центрифужные пробирки (две пробирки по 20 мл), уравновешивают их и вытяжку центрифугируют на рефрижераторной центрифуге 30 мин при 8000.. .10000 g. После этого иадоса-дочную жидкость сливают в чистую колбу (препарат протеиназ) с притертой пробкой и при необходимости ставят в холодильник. Работу по определению активности протеиназ лучше проводить со свежим препаратом.
Приготовление растворов субстратов. В качестве субстратов для определения активности растительных про-теиназ используют 2 %-е растворы химически чистых
препаратов казеина, альбумина или гемоглобина. Про-теолитическая активность ферментов в семядолях двудольных и зерновках злаков обусловлена действием нескольких протеиназ, специфичных для каждого вида растений. Для функционирования отдельно взятой про-теиназы необходимы специфические условия, в том числе и определенная реакция среды. Поэтому активность растительных протеиназ определяют при одинаковых температурном режиме и соотношении субстрат:фер-мент по массе, но при различных значениях pH.
Пример 1, Взвешивают 2 г порошка казеина, помещают в мерную колбу на 100 мл, приливают небольшими порциями, ополаскивая стенки воронки и горлышка колбы, около 80 мл 0,2 М фосфатного буфера с pH 8. Для растворения навески колбу ставят на водяную баню, нагретую до 30.. .40 °С. После растворения казеина содержимое колбы доводят буферным раствором до метки и тщательно перемешивают. Затем в отдельный стаканчик отливают 10 мл раствора и в нем проверяют pH. При необходимости доведения pH до заданной величины добавляют при интенсивном перемешивании несколько капель 1 н. NaOH или 1 н. НС1 (по каплям). Затраченное количество щелочи или кислоты учитывается, и соответствующее их количество вносят в раствор казенна, оставшийся в колбе. Раствор субстрата, вновь перемешивают.
Пример 2. Помещают 2 г порошка гемоглобина в фарфоровую ступку, приливают около 10 мл воды и тщательно растирают, строго следя, чтобы не было комочков и часть белка не осталась на стенках ступки и головке пестика. Затем раствор количественно переносят в стаканчик на 50 мл. Небольшой порцией воды ополаскивают ступку, пестик. Раствор 1 гемоглобина в стаканчике подкисляют 0,3 н. НС1 до pH 3,0, количественно переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят содержимое колбы до метки водой и тщательно перемешивают.
Пример 3. Помещают 2,2 г порошка гемоглобина в колбу на 150 мл и заливают 100 мл ‘/is М фосфатного буфера с pH 6. Колбу плотно закрывают пробкой и ставят в ротатор для взбалтывания и растворения содержимого. После того как гемоглобин растворится (через 15.. .20 мин), колбу снимают с ротатора, вынимают пробку, в раствор вносят 36 г мочевины и оставляют при комнатной температуре на 30.. .40 мин, периодически перемешивая. После растворения мочевины в отдельно взятой пробе проверяют pH и при необходимости доводят до pH 6 растворами 1 и. NaOH или 1 н. НС1.
Результаты записывают по форме (табл. 52).
Определение активности протеиназ. В центрифужные пробирки на 10 мл, пронумерованные по порядку, наливают по 2 мл растворов субстратов: казеина с pH 8 и гемоглобина с pH 3 и pH 6, после чего пробирки помещают на 1.. .2 мин на водяную башо, предварительно нагретую до 30 °С. Когда раст-
52. Определение активности протеиназ
Номер На песка суб Биологический Объем pH
пробирки страта (Л), материал раствора
препарата фер (К), мл
ментов (?), г
Субстраты
1 2,0 Казеин 100 8,0
2 2,0 Гемоглобин 100 3,0
3 2,2 То же 100 6,0
Ферментативные препараты 4 50
Гз 50
G 50
7 50
вор субстрата примет температуру бани, в пробирки вносят по 2 мл ферментного препарата, полученного из семян той или иной культуры в соответствии с заданием преподавателя. Реакция гидролиза белков идет 30 мин при 30 °С. Для равномерного прогревания содержимого пробирки периодически осторожно встряхивают.
Через 30 мин действие протеиназ останавливают добавлением в реакционную смесь 4 мл 10 %-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК).
В трех пробирках готовят контрольные образцы. Для этого в них вносят по 2 мл соответствующих растворов субстратов (растворы казеина и гемоглобина с различными pH) и помещают на водяную баню. Через
