Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка):
пользоваться длительное время, в колбы с раствором вносят по одной-две капли антисептика (толуола, кап-риловой кислоты).
Шкалу и исследуемые растворы окрашивают в градуированных пробирках на 10 мл. В пробирки с номерами по порядку (для шкалы номера — с первого по шестой, далее нумеруют пробирки с исследуемыми растворами) из соответствующих колб наливают по 1 мл раствора белков, добавляют 4 мл биуретового реактива. Содержимое каждой пробирки осторожно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего колориметрируют на спектрофотометре СФ-26, «Спеколе» или фотоэлектроколориметре ФЭК-60 при 540 нм.
Данные, полученные для стандартных растворов, изображают графически. На оси ординат откладывают величины светопоглощения белковых растворов (Е), а на оси абсцисс — концентрацию белка (мг/мл), которая соответствует данному светопоглощению. Пользуясь калибровочной кривой, по величинам оптической плотности исследуемых растворов находят соответствующее количество белка. Рассчитывают общее содержание'белков в семенах исследуемых культур в процессе их прорастания. Результаты записывают по форме (табл. 51).
51. Определение содержания белков
о & Ею
Навеска растительного материала (Я), г
сырого
сухого
ш я —, т
О Эю
Когцецт-рацпя белг;а (С), мг/мл
<о ts. td 5J
Концентрация белка /М-100 % \
\ Н- 1000 J’ 5
Шкала растворов
1 100 0,1
а юо о,з
3 100 0,5
4 100 1,0
5 100 1,5
6 100 2,0
Исследуемые растворы
7
8 9
10
Материалы и оборудование. 1. Проросшие семена гороха, фасоли, пшеницы или ржи, боратный буфер с pH 10, содержащий 0,2 % бисульфита натрия; октиловый спирт; кварцевый песок.
Фарфоровые ступки с пестиками, центрифужные пробирки на 20 и 60 мл, резиновые пробки, мерные цилиндры па 10 и 25 мл, пипетки на 20 мл, мерные колбы на 100 мл, центрифуга типа LZ-402, К-24, спектрофотометр.
2. Проросшие семена гороха, фасоли, пшеницы или ржи, Go-ратный буфер с pH 10,0, казеин или альбумин, биуретовый реактив (0,15 г CuS04-5H20 и 0,6 г NaKCdHiOe^FbO растворяют в 50 мл Н20, затем при активном перемешивании приливают 30 мл 10 %-го раствора NaOH и 0,1 г 1\1, раствор доводят водой до 100 мл), толуол или капрнловая кислота.
Пинетки па 1, НО (с делениями), 15 н 20 мл, мерные колбы па 100 мл, пробирки с делениями на 10 мл, спектрофотометры СФ-26, «Спекол» или ФЭК-60.
Работа 65. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕИНАЗ В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ
Вводные пояснения. Запасные белки расщепляются при участии протеиназ. Активность последних возрастает по мере набухания и прорастания семян, а после уменьшения количества белков в эндосперме (и на определенном этапе в семядолях у двудольных) вновь снижается. Известно несколько сотен протеиназ, которые сгруппированы в классы: сериновые, тиоловые, карбоксильные, металлопротеиназы, аминопептидазы. В каждом классе выделены соответствующие семейства протеиназ. Все протеиназы представляют собой гидролитические ферменты, т. е. расщепляют пептидные связи с участием воды.
Протеиназы, присутствующие в прорастающих семенах, органоспецифичны. Предполагается существование механизма регуляции, обеспечивающего их своевременное действие. Кроме того, видимо, есть протеиназы, активирующие некоторые другие гидролитические ферменты, а также протеиназы, участвующие в обычном кругообороте внутриклеточных белков. Из множества протеолитических ферментов в семенах лишь некоторые участвуют в процессе гидролиза запасных белков при прорастании.
В основу определения суммарной активности протеп-наз положен метод, разработанный Анссном и заключающийся в том, что ферментным препаратом, выделенным из растительного материала (семядолей прорастающих семян гороха, фасоли, бобов или прорастающих зерновок пшеницы и ржи), действуют на раствор како-
го-либо очищенного белка (казеина, альбумина, гемоглобина). Ферментную активность определяют по количеству высвободившихся из белков ароматических аминокислот (тирозина, триптофана) после удаления из раствора непрореагировавших с протсииазами белков и ферментного препарата.
Количество ароматических аминокислот, содержащихся в низкомолекуляриых белках, пептидах и в свободном состоянии, определяют колориметрически с реактивом Фолина или на спектрофотометре при 280 нм. Принято считать (с определенной степенью условности), что активность протеиназ пропорциональна содержанию, в растворе ароматических аминокислот.
Свойства белков, положенные в основу данного метода, служат хорошей иллюстрацией групповой специфичности протеиназ, заключающейся в том, что фермент катализирует расщепление определенных химических связей в отдельных группах близких по строению веществ (протеиназы растений гидролизуют и белок животного происхождения).
