Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка):
. Выделение суммарных белков из сухого растительного материала. Взвешивают на аналитических весах 0,3 г размолотых до состояния муки 'сухих семядолей бобовых или 0,8.. .1 г зерновок, полученных после прорастания. Навеску помещают в коническую колбу на 100 мл, заливают 50 мл боратного буфера с pH 10, содержащего 0,2 % бисульфита натрия и пять-шесть капель октилового спирта. Колбу тщательно закрывают пробкой и оставляют на 1 ч при комнатной температуре, чтобы сухой материал впитал в себя буфер. Затем колбу помещают в ротатор.
Последующие операции при выделении суммарных белков общие для обоих видов экстракции.
Содержимое колб взбалтывают на ротаторе в течение 1 ч. Затем колбы вынимают из ротатора, открывают пробки и дают раствору суммарных белков отстояться в течение 15 мин. Затем при помощи пипетки из верхней части раствора осторожно отбирают 10 мл и количественно переносят в центрифужные пробирки, помещенные в специальный штатив. Пробирки помечают восковым карандашом, уравновешивают между собой (добавляя буфер с pH 10). Если пользуются центрифугой со свинг-ротором, помещают в центрифугу и центрифугируют 15 мин’ (время исчисляют с момента выхода ротора центрифуги на заданное число оборотов). По окончании центрифугирования пробирки помещают в штатив и пипеткой отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в другую чистую стеклянную пробирку. Туда же приливают 9 мл боратного буфера с pH 10,
тщательно перемешивают, после чего раствор суммарных белков готов к спсктрофотометрированию.
Спектрофотометрический метод. Содержание белков можно определить на любом отечественном спектрофотометре. Описание спектрофотометра СФ-26 и приемы работы на нем даны в работе 39.
Ароматические аминокислоты тирозин и триптофан, содержащиеся в белках, поглощают свет в области 280 нм. Однако сильное поглощение ультрафиолетовых лучей в этой области характерно и для нуклеиновых кислот, хотя в делом пик поглощения последними ультрафиолетовых лучей приходится на область спектра 260 нм. Поэтому при определении концентрации белка в растворах названным методом показания светопогло-щегшя (синонимы—оптическая плотность, экстиикция) снимают при 280 и 260 нм. Показания свстопоглощсния шкалы прибора подставляют в уравнение Варбурга — Христиана:
С=1,55-^80-0,76^260;
где- С — концентрация белка, мг/мл; ?28о и Ет —- светопоглощение раствора белков при 280 и 260 нм; 1,55 и 0,76 — расчетные коэффициенты.
В одну из кварцевых кювет спектрофотометра на 2/з объема наливают раствор исходного боратного буфера (эталон) и устанавливают ее в гнездо № 1 кюве-тодержателя. В другие три кюветы помещают исследуемые растворы белков и ставят в гнезда 2, 3, 4 кювето-держателя. Кюветодержатель устанавливают в шовет-иую камеру. Операции по измерению коэффициентов светопоглощеиия эталонного и рабочих растворов аналогичны таковым при определении содержания пигментов в вытяжке из листьев (см. работу 39). Результаты записывают по форме (табл. 49).
Окончательный расчет содержания суммарных белков в навеске злаковых и зернобобовых культур (мг/г сухой массы) выполняют по формуле
С-50-ю 100
ССБ —------- X---------,
II 86 или 60
где И— навеска растительного материала, г; 50 — объем экстрагирующего раствора, мл; 10 — разведение; 86 — сухая масса воз-душпосухой навески, %; 60 — сухая масса проросших семян, %.
49. Определение белков в растении
<0 <и
Навеска рас м ч Светопог ло &
и
тительного н - щение при те % Масса
материала * cd белков
(Я), г «•Г
тС-
1 3 280 нм 260 им
сырого сухого п " (Яачп) (?200) МГ
О !0
Концентрация белков в нареске, .М-100 %
\ н-юоо
1
2
3
4
Колориметрический метод. Анализ начинают с построения калибровочного графика, для чего используют растворы альбумина или казеина.
На аналитических весах отвешивают 1 г казеина и вносят в мерную колбу на 100 мл через воронку для сыпучих веществ, приливают раствор буфера с pH 10 (2/з объема колбы). Колбу плотно закрывают и встряхивают на ротаторе до полного растворения казеина. Затем колбу вынимают из ротатора, содержимое ее доводят буфером до метки, тщательно перемешивают несколько раз, после чего стандартный раствор белка можно считать готовым. В 1 мл такого раствора содержится 10 мг белка. Из рабочего стандартного раствора готовят производные растворы с содержанием белка от 0,1 до 2 мг, или шкалу (табл. 50).
50. Приготовление шкалы раствора
Номер Объем кол Стандартный Еоратный Концентрация
колбы бы, мл раствор ка- буфер с белка, мг/мл
зеи’ а, мл PH Ю, мл
1 100 1 99 0,1
2 100 3 97 0,3
3 100 5 95 0,5
4 100 10 99 1,0
5 100 15 85 1,5
6 100 20 80 2,0
Пипеткой соответствующего объема берут необходимое количество стандартного раствора белка и переносят в пустую колбу на 100 мл, на которой заранее написан номер. Содержимое доводят буферным раствором до метки и перемешивают. Чтобы шкалой молено было
