Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Третьяков Н.Н. -> "Практикум по физиологии растений" -> 46

Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.

Третьяков Н.Н. Практикум по физиологии растений — М.: Агропромиздат, 1990. — 271 c.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка): praktikumpofiziologii1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 102 >> Следующая

Результаты опыта записывают по следующей форме:
Оптическая плотность
Объект На ое с ка контроль опыт Индекс активности
ткаги, мг дегидрогеназ
1 1 1
Материалы и оборудование. Проростки злаков; клубни картофеля или другой растительный материал; Vis М буферная смесь Серенсена III с pH 7,17; хлорид 2, 3, 5-трифенилтетразолия (0,25... 0,5 %-й раствор), приготовленный на буферной смеси Серенсена III; ацетон или изопропиловый спирт.
Бюксы, мерные цилиндры на 10 мл, лезвия безопасной бритвы, фарфоровые ступки, весы торзионные или аналитические, стеклянные пробки, вакуум-эксикаторы, насос Камовского, термостат, центрифуга, фотоэлектроколориметр.
Приготовление буферной смеси Серенсена III. Для приготовления Vis М буферной смеси Серенсена III с pH 7,17 в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,831 г Na2HP04-2H20 и 0,272 г КН2Р04.
Работа 48. ОБНАРУЖЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ
И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕЕ АКТИВНОСТИ
Вводные пояснения. Пероксидаза — фермент, катализирующий окисление полифенолов и некоторых ароматических аминов при помощи кислорода, перекиси водорода или органических перекисей. Пероксидаза образует с перекисью водорода комплексное соединение, в результате чего перекись активируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода.
Порядок работы. Обнаружение пероксидазы в соке клубня картофеля. Основано на изменении окраски при окислении полифенолов в хиноны. Натирают на терке очищенный клубень картофеля. Из мезги отжимают сок через марлю и собирают в колбочку. В четыре пробирки вносят по 5 мл 1 %-го раствора гидрохинона. В первую добавляют, кроме того, 1 мл 3 %-го раствора перекиси водорода и 1 мл картофельного сока, во вторую — 1 мл 3 %-го раствора перекиси водорода, в третью — 1 мл картофельного сока, в четвертую 1 мл предварительно прокипяченного в течение
1 мин картофельного сока и 1 мл перекиси водорода.
При окислении гидрохинона в хинон раствор буреет. Наблюдается некоторое побурение самого картофельного сока без добавления гидрохинона и перекиси водорода, что связано с действием полифенолоксидазы, окисляющей полифенолы тканей картофеля с участием молекулярного кислорода.
Отмечают окраску в пробирках и делают выводы. Результаты опыта записывают по форме (табл. 29).
Определение активности пероксидазы по Бояркину. Метод основан на изменении времени, за которое опытный раствор достигает определенной
29. Обнаружение пероксидазы в соке картофеля
Вариант Состав смеси в пробирке Окраска раст
картофельный перекись гидрохи
сок (носитель водорода нон
пероксидазы)
1 + + 4*
2 --- + +
3 + --- +
4 + +
оптической плотности. В качестве субстрата используют беизидин, в результате окисления которого образуется соединение синего цвета.
Растирают в ступке с водой (или с ацетатным буферным раствором pH 5,4) 50.. .100 мг растительного материала, затем переносят его в мерную колбочку на 25 мл и доводят до метки. Настаивают вытяжку 5... 10 мин и центрифугируют в течение 10 мин при интенсивности вращения 3000 мин-1. Осадок отбрасывают. В иадосадочиой жидкости определяют активность пероксидазы, о которой судят по времени образования синей окраски окисленного бснзидина. Для измерения активности лучше брать такие разведения вытяжки, при которых окраска изменяется в течение 10.. .40 с, так как активность фермента прямо пропорциональна его концентрации только в самом начале реакции. Определение ведут на ФЭК с желтым светофильтром.
В две кюветы толщиной 2 см наливают по 2 мл вытяжки, 2 мл буферного раствора, 2 мл беизидина в каждую. Ставят кюветы в кюветодсржатели прибора, одну слева (контроль), другую справа (опыт), при помощи оптических клиньев уравнивают оба световых потока (при этом стрелка гальванометра встает в нулевое положение). Уравнивают световые потоки сначала при чувствительности «1», затем при чувствительности «2», при которой и ведут определение. Правый отсчетный барабан ставят на деление 0,250 шкалы оптической плотности, при этом стрелка гальванометра смещается в сторону.
В левую кювету наливают 2 мл воды, в правую —
2 мл 0,03 %-го раствора перекиси водорода пипеткой с широким- носиком. При этом сильная струя перемешивает содержимое кюветы. Одновременно с падением
первой капли включают секундомер. В опытной кювете раствор синеет, стрелка гальванометра передвигается к нулевому положению. Отмечают время от начала приливания перекиси водорода до достижения раствором заданной оптической плотности; при этом стрелка гальванометра достигает нулевого положения. Проводят три определения и берут среднее значение. Активность фермента рассчитывают по формуле
л_ D• (q-P-v)
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 102 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed