Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Третьяков Н.Н. -> "Практикум по физиологии растений" -> 37

Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.

Третьяков Н.Н. Практикум по физиологии растений — М.: Агропромиздат, 1990. — 271 c.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка): praktikumpofiziologii1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 102 >> Следующая

Двухмерная хроматография, применяющаяся для массовых количественных определений, сложна и трудоемка. Поэтому в практикуме используют разделение основных пигментов зеленого листа на одномерной хроматограмме, разработанной Хагером. Его методика обладает рядом преимуществ, к числу которых следует отнести большую скорость разделения и получение достаточного количества отдельных пигментов.
Пигменты извлекают из листовой ткани смесыо ацетона и бензина с соотношением 4:1 и после фильтрации отделяют бензиновую фракцию, содержащую все пигменты, от ацетона. Полученную в конечном итоге бензиновую фракцию используют для хроматографического разделения пигментов. При хроматографировании получают пять полос пигментов, хорошо отделенных друг от друга, в такой последовательности (от стартовой линии): хлорофилл Ъ, хлоро'филл а, виолаксантии, лютеии и каротины.
Порядок работы. Получение вытяжки. Для анализа отбирают листья определенного яруса, вырезают центральную жилку, а из оставшихся частей берут навеску 0,5 г. Величина -навески может меняться в зависимости от содержания пигментов.
Отвешенную пробу быстро измельчают ножницами, переносят в фарфоровую ступку и тщательно растира-
ют с чистым кварцевым песком, предварительно внеся в ступку на кончике ножа СаС03 для нейтрализации кислот клеточного сока. Затем приливают 3.. .4 мл смеси ацетона с бензином ('24 мл ацетона и 6 мл бензина) и продолжают растирать вместе с растворителями. Смазав снизу носик ступки вазелином, экстракт сливают по палочке в воронку со стеклянным фильтром № 2, соединенную каучуковой трубкой с градуированной вакуумной пробиркой или колбой Бунзена, и отсасывают.
К оставшейся в ступке массе приливают 3.. .4 мл смеси растворителей и вновь растирают. Затем жидкость сливают в воронку и отсасывают. Экстрагирование пигментов из растительного материала повторяют до тех пор, пока сливная жидкость не станет бесцветной. Далее материал переносят на фильтр, ступку ополаскивают небольшим количеством смеси растворителей и сливают эту жидкость в воронку. Через 2.. .3 мин отсасывают. После этого объем экстракта количественно доводят смесыо растворителей до 25 мл (в случае использования колбы Бунзена экстракт переносят в мерную колбу на 25 мл).
Полученный после фильтрования экстракт переносят в делительную воронку и отмывают от ацетона. Для этого в воронку сначала приливают 20 мл насыщенного раствора NaCl и слегка взбалтывают жидкость. После расслоения водно-ацетоновый слой сливают через кран воронки в приемник. Промывают еще раз 20 мл раствора NaCl, а затем пять-шесть раз 20 мл дистиллированной воды.
Отмытый от ацетона раствор пигментов переносят в градуированную пробирку на 10 мл с хорошо прокаленным сульфатом натрия до объема, соответствующего 2 мл для обезвоживания экстракта. Затем содержимое пробирки доводят бензином до объема 7 мл.
Разделение пигментов. Берут лист хроматографической бумаги размером 25x5 см и на одном его конце, отступив от края 2,5 см, проводят простым карандашом при помощи линейки тонкую линию. Бумагу зажимают между чистыми стеклянными пластинками так, чтобы линия находилась «выше пластин (рис. 17). Вдоль линии калиброванной пипеткой с оттянутым носиком наносят 0,5 мл бензинового экстракта пигментов (в виде узкой полосы). Для анализа необходим
Рис. 17. Разделение пигментов:
а — нанесение вытяжки на хроматографическую бумагу: 1 — хроматографическая бумага; 2 — место нанесения смеси пигментов; 3 — стеклянные пластинки; б — общий вид сосуда для восходящей хроматографии: 1 — корковая пробка;
2—-нитка; 3 — стеклянный сосуд;
4 — хроматографическая бумага;
5 — смесь растворителей
сравнительно большой объем раствора, поэтому наносить раствор надо в несколько приемов: каждую следующую порцию после подсушивания предыдущей в токе воздуха от вентилятора или фена.
Зона с вытяжкой пигментов не должна быть шире 0,5 см. После нанесения указанного количества вытяжки противоположный край хроматографической бумаги загибают на 2.. .2,5 см и закрепляют лист на нитке скрепкой. Подготовленную таким образом бумагу опускают в цилиндр высотой 25 см, диаметром 7 см, со смесью растворителей следующего состава, мл: бензин — 50,
бензол — 35, хлороформ — 10, ацетон — 0,5 и изопропиловый спирт — 0,17.
Цилиндр плотно закрывают корковой пробкой или деревянной крышкой, оставив оба конца нитки на его внешней стороне. При помощи концов нитки лист хроматографической бумаги устанавливают в цилиндре так, чтобы его нижний конец был опущен в смесь растворителей на 1 см, а края не касались стенок. После этого цилиндр закрывают темным чехлом из плотной бумаги или ткани. Через 45 мин наблюдается полное разделение пигментов, которые располагаются следующим образом (от места нанесения вытяжки): хлорофилл Ь, хлорофилл а, виолаксантип, лютеии, каротины.
Хроматограмму вынимают из цилиндра и просушивают при помощи вентилятора или фена. Затем обводят простым карандашом зоны с соответствующими пигментами и вырезают их ножницами. Полоски разрезают на
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 102 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed