Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка):
Анализ пигментов выполняют при комнатной температуре на рассеянном свету, так как при сильном освещении может произойти фотоокисление хлорофилла. Хранят вытяжку в темном холодном месте.
Определение концентрации хлорофилла на ,ф от оэлеитро колориметре ФЭК-56М. Для установления концентрации окрашенных растворов на фотоэлектроколориметре измеряют разность силы электрических токов, возникающих между двумя фотоэлементами в результате неодинаковой интенсивности световых потоков, прошедших через растворитель и раствор. Общий вид фотоэлектроколориметра ФЭК-56М представлен на рисунке 14. Прибор снабжен набором кювет с различными расстояниями между рабочими гранями. Это дает возможность выбрать для раствора кювету такой рабочей длины, которая позволяла бы выполнять измерение на участке шкалы, дающем наиболее надежные результаты. Так, для хлорофилла этот интервал расположен между 0,1 и 0,4 делениями красной шкалы левого барабана.
Включают прибор в сеть и тумблер стабилизатора ставят в положение «Включ.». Прибору дают прогреться 30 мин. Затем при закрытой шторке 7 вращением отсчетных барабанов 2 совмещают риску с «0» делением шкалы, после чего при помощи рукоятки 4 устанавливают стрелку гальванометра 1 на «0». Далее открывают крышку прибора 8 и в левый кюветодержатель ставят кювету с растворителем (10 мм), а в правый— соответственно кюветы с растворителем и исследуемым раствором. В кюветодержателях все кюветы должны быть установлены на одинаковом расстоянии от входного отверстия и обращены к источнику света одной и той же гранью; Рабочие грани кювет следует протереть фильтровальной бумагой. Чтобы не загрязнить их, нельзя касаться этих граней ниже уровня жидкости.
Поместив кюветы и открыв шторку 7, вращением барабана 5 ставят красный фильтр (напротив световых потоков должны стоять кюветы с растворителем) и доводят стрелку гальванометра до деления «О» при помощи рукоятки 4. Затем поворотом барабана 10 в правом световом пучке заменяют кюветы с растворителем на кювету с исследуемым раствором. Вращением левого отсчетного барабана устанавливают стрелку гальванометра иа «О» и записывают величину * оптической плотности по красной шкале. Измерение выполняют не менее трех раз и, исходя из полученных данных, вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности.
Показания шкалы барабана переводят в величины концентрации, используя калибровочный график. Для
Рис. 14. Фотоэлектроколориметр ФЭК-56М:
1 — гальванометр; 2, 12 ~~ окна отсчетных барабанов со шкалой; 3 — рукоятка чувствительности; 4 — рукоятка установки стрелки гальванометра на «О»; 5 — барабан переключателя светофильтров; 6 — корпус прибора; 7 — рукоятка шторки; 8 — крышка; 9 —• кюветодержатеди; 10 —« барабан правого кювето-держателя; 11 — барабаны отсчета
этого готовят серию стандартных растворов хлорофилла возрастающей концентрации и находят оптическую плотность каждого из них. Затем строят график. На оси абсцисс откладывают значения концентрации, а на оси ординат—соответствующие им значения оптической плотности. Точки пересечения соединяют и получают калибровочный график.
Стандартные растворы готовят в мерных колбочках на 25 мл; концентрацию исходного раствора хлорофилла обычно определяют на спектрофотометре. В качестве стандартного можно использовать также раствор Гётри. Кюветы должны быть той же рабочей длины, что и при определении оптической плотности исследуемого раствора.
Чтобы вычислить концентрацию хлорофилла, на оси ординат находят установленную величину оптической плотности и от нее проводят горизонтальную прямую до пересечения с кривой графика. Из точки пересечения опускают, перпендикуляр на абсциссу и определяют концентрацию хлорофилла. Ее выражают в процентах массы сырых листьев. Расчет ведут по формуле
Х = -^,
А
где В—количество хлорофилла в вытяжке, мг; А — масса сырых листьев, взятых для .анализа, мг; 100 — коэффициент для выражения в процентах.
Результаты определения записывают по форме:
Объект Вари Нарес- Объем Показания Количество хлоро Содержание
ант ка лис вытяж шкалы ба филла по калибро хлорофилла,
с пыта тьев, ки, мл рабана вочной кривой, % массы сы
мг мг па 25 мл рых листьев
1 ' |
Определение концентрации хлорофилла и каротиноидов на спектрофотометре СФ-26. Спектрофотометрический анализ — наиболее точный количественный метод определения содержания пигментов листа. Как и на фотоэлектроколориметре, концентрация пигментов на спектрофотометре определяется по оптической плотности. Однако в отличие от первого спектрофотометр позволяет выполнять анализ смесей веществ с близкими максимумами поглощения,
что достигается за ,счет использования монохроматора, вследствие чего удается установить содержание хлорофиллов и каротиноидов в вытяжке без предварительно-го разделения. Плотность экстракта на спектрофотометре измеряют при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения хлорофиллов а и b в красной области спектра и при длине волны абсорбционного максимума каротиноидов. При этом учитывают, что положение максимума поглощения несколько меняется в зависимости от используемого растворителя. Концентрацию пигментов рассчитывают по уравнениям:
