Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка):
После десяти-пятнадцатиминутного освещения впервой пробирке в результате восстановления метиленовый красный обесцвечивается, и раствор вновь приобретает зеленую окраску. В опытных пробирках окраска раствора не меняется, так как без света, аскорбиновой кислоты или хлорофилла метиленовый красный не восстанавливается.
Результаты опыта записывают по форме '(табл. 24). 24. Определение фотосенсибилизирующего действия хлорофилла
Состав смеси в пробирках
хлоро ЭТИЛО кристалли насыщенный спиртовой Услсвия
филл, ВЫЙ ческая аскор раствор метилеювого
мл спирт, биновая красного
мл кислота, мг
5 --- 50 Добавляют до появле Свет
ния красно-бурой окрас
ки
5 --- 50 То же Темнота
5 --- --- » Свет
--- 5 50 » »
Материалы и оборудование. Метиленовый красный (насыщенный раствор в этиловом спирте), раствор хлорофилла (спиртовая вытяжка из листьев), аскорбиновая кислота (кристаллическая).
Градуированные пипетки на 10 мл, пипетки на ,1 мл, пробирки, штативы, электрические лампы на 3(00 Вт, плоские стеклянные сосуды с параллельными стенками.
Работа 39. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПИГМЕНТОВ
Вводные пояснения. Хлорофилл и каротиноиды — важнейшие компоненты фотосинтетического аппарата листьев. Количественное их содержание в листьях зависит от жизнедеятельности организма, его генетической природы'. Поэтому оно может быть использовано как физиологический показатель, характеризующий онтогенетические, возрастные и генетические особенности растений. Количество пигментов отражает и реакцию растительного организма на условия произрастания. Поэтому при физиологических исследованиях часто возникает необходимость проследить за динамикой содержания хлорофилла и каротиноидов в отдельных органах.
Для извлечения пигментов из листьев применяют полярные растворители (этиловый спирт, ацетон) или смесь полярных и неполярных (петролейный эфир; гек-сан, бензин, бензол) растворителей. Выбор растворителя зависит от условий опыта и объекта исследования. Наиболее часто используют этиловый спирт и ацетон.
Пигменты лучше всего экстрагировать из свежего растительного материала, но можно и из фиксированного. В последнем случае надежным способом фикса-
ции служит замораживание тканей с последующей лио-филизацией (лиофильная сушка). Недопустимо фиксирование растительного материала сухим жаром в сушильном шкафу, поскольку постепенное повышение температуры сопровождается усилением гидролитических процессов, и в том числе гидролиза хлорофилла. Фиксированные листья помещают в эксикатор и хранят в темном и прохладном месте. При работе с сухим материалом берут 80 %-й раствор ацетона или 90 %-й этилового спирта.
Вытяжку используют для количественного анализа. Концентрацию пигментов определяют при помощи фотоэлектроколориметра или спектрофотометра. При этом надо различать учет пигментов в экстракте до' разделения и после разделения на отдельные компоненты. Например, в спиртовой или ацетоновой вытяжке, содержащей все пигменты, можно определить концентрацию хлорофиллов, не отделяя их от каротиноидов, фото-электроколориметром. Это возможно, потому что для хлорофиллов в отличие от каротиноидов характерно поглощение и в красной части спектра.
Количество каротиноидов в смеси с хлорофиллами можно определить только на спектрофотометре. Для более тонкого количественного анализа пигментной системы листьев предварительно осуществляют се разделение хроматографическим методом. Содержание пигментов выражают: в миллиграммах на единицу сырой или сухой массы (на 1 г), в процентах сырой (сухой) массы и на единицу площади листьев (дм2).
Порядок работы. Получение ацетоновой вытяжки. Навеску листьев определенного яруса (0,1...0,'15 г) помещают в фарфоровую ступку, добавляют немного диоксида кальция, промытого кварцевого песка и растирают с 2.. .3 мл 85 %-го раствора ацетона. К растертой массе добавляют 4. . .5 мл ацетона и снова растирают несколько минут. После отстаивания раствора пижшою сторону носика ступки слегка смазывают вазелином, экстракт осторожно сливают по палочке в воронку со стеклянным фильтром № 2 и отсасывают насосом.
Перед перенесением вытяжки воронку вставляют при помощи каучуковой пробки в колбу Бунзена (или градуированную вакуумную пробирку), соединенную с насосом. Экстракцию небольшими порциями чистого
растворителя повторяют до тех пор, пока пигменты не будут извлечены полностью. Затем фильтрат переливают через сухую стеклянную воронку в мерную колбочку на 25 мл. Колбу Бунзена дважды ополаскивают небольшой порцией ацетона, каждый раз сливая жидкость в мерную колбочку. Далее содержимое колбочки доводят растворителем до метки, закрывают каучуковой пробкой, тщательно взбалтывают и используют для определения концентрации пигментов.
