Биология в 3 томах. Tом 3 - Тейлор Д.
ISBN 5-03-003687-3
Скачать (прямая ссылка):
В зависимости от природы используемой неподвижной среды различают три главных типа хроматографии: бумажную, колоночную и тонкослойную. Бумажная хроматография описана в опытах П. 1.1.—П. 1.3. и в разд. 7.6.3. Различные хроматографические методики широко используются в настоящее время в химии, биологии, биохимии и в таких специальных областях, как судебная медицина.
Электрофорез
Электрофорез представляет собой одну из модификаций хроматографии, применяемую для разделения молекул, несущих заряды. В хроматографической среде под влиянием приложенного электрического поля одна сторона оказывается заряженной положительно, а другая — отрицательно. Отдельные молекулы в разделяемой смеси движутся к той или другой стороне в зависимости от их относительных масс и зарядов. Электрофорез широко применяется для выделения и идентификации аминокислот; дальнейшее усовершенствование методики достигается в этом случае регулированием pH среды.
П. 1.7.1. Величины Rf
При хроматографии подвижность растворенного вещества относительно фронта растворителя постоянна для данного вещества. Это может быть выражено величиной Rf как показано ниже:
Расстояние, пройденное растворенным веществом f Расстояние, пройденное фронтом растворителя
Если фронт растворителя выходит за пределы бумаги, то подвижность данного растворенного вещества можно выразить в сравнении с подвижностью другого стандартного вещества. Тогда
Расстояние, пройденное растворенным веществом
Rx =-- Расстояние, пройденное стандартным веществом х
См. рис. П. 1.6, В.
П. 1.7.2. Двухмерная бумажная хроматография
Хроматографией, идущей только в одном направлении, не всегда можно эффективно разделить сложную смесь
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3
Приложения
375
Добавленная вода Желтый Голубой
Крышка
(большая чашка Петри)
Хроматографическая бумага
Маленькая чашка Петри
Пробка " с кнопкой
Восходящий фронт растворителя
Полоска
- хроматографической бумаги
Пятно
- разделяемой смеси веществ
- Растворитель
В
Фронт
растворителя
г©
Пятна стандартных веществ
ь
а
г©
•Г
а
с
\ У
Стартовая линия
Rf
_ а ~6
Двухмерная хроматограмма (первый пробег)
(второй пробег)
Сторона X
Сторона Y
Пятно смеси веществ A1B1C1 D1EmF.
Рис. П. 1.6. Методы хроматографии.
веществ. В этом случае для лучшего разрешения пятен должно быть проведено дополнительное разделение в перпендикулярном направлении с использованием второго растворителя (рис. П. 1.6, Г).
Для этого используют квадратный лист бумаги. Образец наносят на стартовую линию около одного из углов и проводят разделение в первом направлении. Бумагу вынимают из камеры, сушат, поворачивают на 90° и проводят повторное хроматографическое разделение, используя растворитель с иными свойствами. В результате вещества, частично разделенные после первого пробега, окончательно разделяются во втором растворителе. Бумагу вынимают, сушат и выявляют разделенные вещества соответствующим реактивом. Идентифицировать данное вещество можно, сравнив его местоположение с положением известных стандартных веществ. Такой метод использовал Кальвин в экспериментах по идентификации первичных продуктов фотосинтеза (разд. 7.6.3).
Прежде чем начать хроматографию веществ, которые вам необходимо идентифицировать, следует попрактиковаться в этом, используя цветные чернила или индика-
торы. Проведя опыты, которые описаны ниже, вы убедитесь, что чем концентрированнее стартовое пятно, тем лучше пойдет разделение. Вы убедитесь также в том, что разделение проходит лучше при более длинном хрома-то графическом пробеге.
Опыт П. 1.1. Разделение индикаторов
Материалы и оборудование
Хроматографическая бумага ватман № 1 или № 3 Метиловый оранжевый (защищенный) Бутылка с аммиаком 880 Чашка Петри Пипетка
Методика
Нанесите каплю защищенного метилового оранжевого в центр хроматографической бумаги. Высушите бумагу, помахав ею в воздухе, немного подержите ее над открытой бутылкой аммиака 880 и затем положите на чашку Петри (рис. П. 1.6, А). Капните одну каплю воды на пятно индикатора.
Наблюдаемый эффект
Два индикатора, содержащиеся в растворе метилового оранжевого, движутся центробежно с разными скоростями, причем синее кольцо движется быстрее желтого. Синее кольцо — это индикатор бромтимоловый синий, а желтое — метиловый оранжевый.
Опыт П.1.2. Разделение цветных чернил на составляющие компоненты
Материалы и оборудование
Лабораторная пробирка Пробка
Хроматографическая бумага Канцелярская кнопка Фломастеры Дистиллированная вода
Методика
1. Возьмите пробирку и пробку (см. рис. П. 1.6, Б) и прикрепите прямоугольник из хроматографической бумаги к пробке с помощью кнопки. Параллельно свободному концу хроматографической бумаги на расстоянии примерно 1 см от края проведите карандашом линию.
2. Разметьте стартовую линию крестиками через равные интервалы; на каждый цвет чернил должно приходиться по одному крестику.