Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Тейлор Д. -> "Биология в 3 томах. Tом 3" -> 121

Биология в 3 томах. Tом 3 - Тейлор Д.

Тейлор Д. , Грин Н., Стаут У. Биология в 3 томах. Tом 3. Под редакцией Сопера Р. — М.: Мир, 2004. — 451 c.
ISBN 5-03-003687-3
Скачать (прямая ссылка): biolv3tt32004.PDF
Предыдущая << 1 .. 115 116 117 118 119 120 < 121 > 122 123 124 125 126 127 .. 280 >> Следующая


Если для выделения донорной ДНК (например, методом «дробовика») использовали рестриктазу, той же самой рестриктазой должна быть обработана плазмидная ДНК. Рестрикци-онные фрагменты донорной ДНК, среди которых есть и фрагмент с нужным геном, смешивают затем с плазмидной ДНК. При смешивании они соединяются липкими концами. Например, липкий конец —AATT будет соединяться с комплементарным липким концом —ТТАА. Вначале соединение происходит за счет водородных связей, но после добавления фермента, называемого ДНК-лигазой, образуются фосфодиэфирные связи.

Если в качестве донорной ДНК используется кДНК или синтетический ген (см. выше два первых метода выделения генов), то для встраивания ДНК в вектор следует действовать по схеме, представленной нарис. 25.6. Та же процедура необходима, если при использовании метода «дробовика» применялся фермент, образующий тупые концы.

Рис. 25.6. Добавление липких концов к фрагменту ДНК, имеющему тупые концы, перед встраиванием ДНК в вектор с целью создания рекомбинантной молекулы ДНК.

Фаговый вектор

Преимуществом фагов как векторов является возможность клонирования больших фрагментов ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой цели используют фаг X (рис. 2.20). Часть фаговой ДНК заменяют на ДНК, которую нужно клонировать. Эта часть не нужна для репликации фаговой ДНК в бактериальной клетке-хозяине, поэтому клонирование не нарушается. Схематически эта процедура представлена на рис. 25.7.

БОТАНИКА

ММА им. И.М. Сеченова

Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3

Прикладная генетика 223

Очищенная фаговая ДНК

Удаление части фаговой ДНК с помощью той же рестриктазы, которую использовали для приготовления чужеродной ДНК

Чужеродная ДНК

ДНК-лигаза

Рекомбинантная ДНК

Добавление к фагу

Фаговый вектор, содержащий рекомбинантную ДНК

Инфицирование клеток ? coli

Рис. 25.7. Включение ДНК в фаговый вектор.

Часто в ней используют донорную ДНК, полученную методом «дробовика».

рии хорошо изучена, а также потому, что она быстро растет (время удвоения составляет около 30 мин). Для генной инженерии получен специальный мутант Е. coli, выживающий только в особых лабораторных условиях. Поэтому он не способен заразить человека, если случайно попадет в окружающую среду вместе с чужеродными генами, которые он содержит.

При использовании плазмидного вектора препарат плазмиды добавляют в пробирку, содержащую культуру Е. coli. Туда же вносят ионы кальция (обычно в виде хлорида кальция) и клетки подвергают короткому тепловому шоку. В результате в клеточной мембране Е. coli^ быстро образуются поры, через которые плазмиды проникают внутрь клетки. Процесс введения новой ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией.

Фаговые векторы вводят в клетки путем инфицирования бактериального газона, растущего на чашках с агаризованной средой (разд. 12.8).

25.1.5. Этап 4. Клонирование ДНК

Одна-единственная фаговая частица, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК, может менее чем за один день образовать более 1012 идентичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки Е. coli, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашках Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со временем образуя видимые колонии. При этом появляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтезируются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают миллиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейшее клонирование, нужно провести отбор трансформированных бактерий.

25.1.4. тап 3. Введение вектора в хозяйскую клетку

На данном этапе фаговый или плазмидный вектор вводят в бактериальную клетку, в которой он сможет размножаться (клонировать себя и чужеродную донорную ДНК, которую он содержит). Как правило, для этих целей используют бактерию Escherichia coli — обычного обитателя кишечника человека. Кишечная палочка выбрана для этой цели потому, что генетика этой бакте-

Отбор трансформированных бактерий

Рассмотрим ситуацию, когда в качестве вектора были использованы плазмиды. Когда плаз-мидную ДНК смешивают с бактериальной культурой, возникают две проблемы. Во-первых, не все бактерии трансформируются (получают плазмиды). Во-вторых, не все плазмиды несут чужеродную донорную ДНК. Эти проблемы искусно обходят, используя плазмиды,

БОТАНИКА

Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3

224 Глава 25

Участок, содержащий сайты рестрикции (обозначены линиями), т. е. здесь ДНК может быть разрезана рестриктазами с целью встраивания чужеродной ДНК

Ген

устойчивости к-ампициллину

Ген ?-галакто-зидазы (обозначен точками)

Рис. 25.8. Плазмидный вектор, содержащий ген устойчивости к антибиотику ампициллину. Благодаря присутствию такого гена мы имеем возможность на среде с ампициллином отбирать клетки, несущие плазмиду. Клетки, не содержащие плазмиду, на такой среде погибают.

которые обладают двумя особыми свойствами (рис. 25.8).
Предыдущая << 1 .. 115 116 117 118 119 120 < 121 > 122 123 124 125 126 127 .. 280 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed