Биология в 3 томах. Tом 3 - Тейлор Д.
ISBN 5-03-003687-3
Скачать (прямая ссылка):
Если для выделения донорной ДНК (например, методом «дробовика») использовали рестриктазу, той же самой рестриктазой должна быть обработана плазмидная ДНК. Рестрикци-онные фрагменты донорной ДНК, среди которых есть и фрагмент с нужным геном, смешивают затем с плазмидной ДНК. При смешивании они соединяются липкими концами. Например, липкий конец —AATT будет соединяться с комплементарным липким концом —ТТАА. Вначале соединение происходит за счет водородных связей, но после добавления фермента, называемого ДНК-лигазой, образуются фосфодиэфирные связи.
Если в качестве донорной ДНК используется кДНК или синтетический ген (см. выше два первых метода выделения генов), то для встраивания ДНК в вектор следует действовать по схеме, представленной нарис. 25.6. Та же процедура необходима, если при использовании метода «дробовика» применялся фермент, образующий тупые концы.
Рис. 25.6. Добавление липких концов к фрагменту ДНК, имеющему тупые концы, перед встраиванием ДНК в вектор с целью создания рекомбинантной молекулы ДНК.
Фаговый вектор
Преимуществом фагов как векторов является возможность клонирования больших фрагментов ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой цели используют фаг X (рис. 2.20). Часть фаговой ДНК заменяют на ДНК, которую нужно клонировать. Эта часть не нужна для репликации фаговой ДНК в бактериальной клетке-хозяине, поэтому клонирование не нарушается. Схематически эта процедура представлена на рис. 25.7.
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3
Прикладная генетика 223
Очищенная фаговая ДНК
Удаление части фаговой ДНК с помощью той же рестриктазы, которую использовали для приготовления чужеродной ДНК
Чужеродная ДНК
ДНК-лигаза
Рекомбинантная ДНК
Добавление к фагу
Фаговый вектор, содержащий рекомбинантную ДНК
Инфицирование клеток ? coli
Рис. 25.7. Включение ДНК в фаговый вектор.
Часто в ней используют донорную ДНК, полученную методом «дробовика».
рии хорошо изучена, а также потому, что она быстро растет (время удвоения составляет около 30 мин). Для генной инженерии получен специальный мутант Е. coli, выживающий только в особых лабораторных условиях. Поэтому он не способен заразить человека, если случайно попадет в окружающую среду вместе с чужеродными генами, которые он содержит.
При использовании плазмидного вектора препарат плазмиды добавляют в пробирку, содержащую культуру Е. coli. Туда же вносят ионы кальция (обычно в виде хлорида кальция) и клетки подвергают короткому тепловому шоку. В результате в клеточной мембране Е. coli^ быстро образуются поры, через которые плазмиды проникают внутрь клетки. Процесс введения новой ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией.
Фаговые векторы вводят в клетки путем инфицирования бактериального газона, растущего на чашках с агаризованной средой (разд. 12.8).
25.1.5. Этап 4. Клонирование ДНК
Одна-единственная фаговая частица, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК, может менее чем за один день образовать более 1012 идентичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки Е. coli, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашках Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со временем образуя видимые колонии. При этом появляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтезируются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают миллиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейшее клонирование, нужно провести отбор трансформированных бактерий.
25.1.4. тап 3. Введение вектора в хозяйскую клетку
На данном этапе фаговый или плазмидный вектор вводят в бактериальную клетку, в которой он сможет размножаться (клонировать себя и чужеродную донорную ДНК, которую он содержит). Как правило, для этих целей используют бактерию Escherichia coli — обычного обитателя кишечника человека. Кишечная палочка выбрана для этой цели потому, что генетика этой бакте-
Отбор трансформированных бактерий
Рассмотрим ситуацию, когда в качестве вектора были использованы плазмиды. Когда плаз-мидную ДНК смешивают с бактериальной культурой, возникают две проблемы. Во-первых, не все бактерии трансформируются (получают плазмиды). Во-вторых, не все плазмиды несут чужеродную донорную ДНК. Эти проблемы искусно обходят, используя плазмиды,
БОТАНИКА
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3
224 Глава 25
Участок, содержащий сайты рестрикции (обозначены линиями), т. е. здесь ДНК может быть разрезана рестриктазами с целью встраивания чужеродной ДНК
Ген
устойчивости к-ампициллину
Ген ?-галакто-зидазы (обозначен точками)
Рис. 25.8. Плазмидный вектор, содержащий ген устойчивости к антибиотику ампициллину. Благодаря присутствию такого гена мы имеем возможность на среде с ампициллином отбирать клетки, несущие плазмиду. Клетки, не содержащие плазмиду, на такой среде погибают.
которые обладают двумя особыми свойствами (рис. 25.8).