Биология в 3 томах. Tом 3 - Тейлор Д.
ISBN 5-03-003687-3
Скачать (прямая ссылка):
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3
218
Глава 25
Плазмида — небольшая кольцевая молекула ДНК
Ген устойчивости к антибиотику (см. текст)
Разрезание рестриктазой, после которого остаются липкие концы (короткие одноцепочечные
участки ДНК по ^ ^ обе стороны от разреза, \у комплементарные друг другу)
Ген ?-галактозидазы (см. текст)
Сайты узнавания для рестриктаз
Одноцепочечная комплементарная ДНК
мРНК кДНК^
мРНК
Обратная транскриптаза
Обработка щелочью для разрушения " мРНК
Комплементарная ДНК-копия (кДНК)
ДНК-полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК
?*0Ъ0Ъ0Ъ0ъ» Двухцепочечная кДНК
Добавление липких концов
Двухцепочечная ДНК
ипкие концы (одноцепочечные)
Синтетический ген
Добавление ДНК, которую нужно клонировать; фермент ДНК-лигаза сшивает чужеродную ДНК с плазмидной ДНК
Плазмидный вектор на основе рекомбинантной ДНК
Рестрикционный фрагмент,
полученный при разрезании ДНК рестриктазами (см. текст)
Чужеродная ДНК, которую нужно клонировать
Плазмида, несущая ДНК, которую нужно клонировать, внутри бактерии
Трансформация
<7
Бактерия (например, Е. coli)
Плазмида используемся в качестве вектора (переносчика) чужеродной ДНК, которая может представлять собой новый ген. Плазмида реплицируется внутри бактерии, образуя много идентичных копий (клонов) самой себя и нового гена
Бактерия использует новый ген для синтеза белка. Трансформированные клетки идентифицируют, выделяют и наращивают в ферментерах для промышленного производства белка
Рис. 25.1. Генная инженерия. Схема процедуры, разработанной для клонирования генов. Детали объясняются в тексте.
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3
Синтез гена
Последовательность оснований в гене можно определить либо непосредственно, либо исходя из аминокислотной последовательности белка, кодируемого этим геном. Затем можно сконструировать ген из нуклеотидов (напомним, что каждое основание является частью одного нуклеотида), соединив их друг с другом в правильном порядке. Сейчас таким способом удается конструировать только короткие гены, однако с усовершенствованием методов синтез любого гена станет рутинной процедурой. Этот метод был использован для получения генов проинсу-лина и соматостатина. Соматостатин (известный также как ингибитор гормона роста) — это белковый гормон, состоящий всего из 14 аминокислот.
Метод «дробовика» - использование рестрикционных ферментов
Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикци-онными (от англ. restricting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эн-донуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, «нуклеаза») в строго определенных точках («эндо» означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отношении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метальной группы.
Название каждого фермента происходит от названия бактерии, из которой его выделя-
_Прикладная генетика 219
ют (рис. 25.2). Обратите внимание на то, что рестрицируемая последовательность-мишень часто имеет шесть оснований в длину и является палиндромной, т. е. читается одинаково в обоих направлениях. Рассматривая рис. 25.2, помните, что две комплементарные цепи ДНК считываются в противоположных направлениях. Некоторые рестриктазы производят ступенчатые надрезы. В результате их действия образуются фрагменты ДНК с выступающими одноцепочечными концами (например, EcoRl, (рис. 25.2). Такие концы называются «липкими»; их используют для воссоединения фрагментов ДНК. Они как бы слипаются за счет образования водородных связей с комплементарными липкими концами других молекул ДНК, разрезанных той же рестриктазой (рис. 25.1). Например, широко используемая рестриктаза EcoRl образует липкий конец — ТТАА. Есть рестриктазы, формирующие тупые концы. К ним относится, например, Hindll (рис. 25.2). С помощью рестриктаз ДНК любого организма можно фрагментировать. Длина образовавшихся рестрикционных фрагментов зависит от типа используемой рестрикционной эндонуклеазы и от того, где расположены последовательности оснований, которые узнаются данным ферментом (рис. 25.3).
Известно, что каждый нуклеотид в ДНК несет фосфатную группу, которая заряжена отрицательно, поэтому фрагменты ДНК различной длины заряжены неодинаково. Эти различия можно использовать для разделения фрагментов ДНК в электрическом поле методом гель-электрофореза (рис. 25.4). Как следует из названия метода, он предполагает использование агарозного (для очень больших фрагментов) или полиакриламидного (для фрагментов меньших размеров) геля. Поскольку ДНК бесцветна, положение того или иного фрагмента в геле после электрофореза выявляют либо с помощью окрашивания, либо используя радиоактивно меченную ДНК и проводя радиоавтографию, в ходе которой на гель накладывают фотографическую пленку. Радиоактивное излучение засвечивает пленку в том месте, где расположена ДНК.
