Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
различных электродов; данные о них суммированы в недавно вышедшей книге
Гилболта [16].
В ферментных электродах ферменты обычно иммобилизуют, что позволяет
уменьшить расход материалов для проведения рутинных анализов и исключить
частую' проверку ферментного препарата для получения воспроизводимых
результатов. Кроме того, устойчивость фермента часто увеличивается при
введении его в подходящий гелевый носитель. Например, электрод для
определения мочевины с химически связанной уреазой на поверхности
аммонийного ИСЭ может работать более 300 дней [16].
И оно селективные электроды и биосспсоры па их основе
121
Для иммобилизации фермента используют два метода: химическую модификацию
фермента введением групп, снижающих его растворимость, и физический
захват фермента инертным носителем, например крахмалом или
полиакриламидом (гл. 6). Для изготовления электродных датчиков более
всего подходит химическая иммобилизация.
Функционирование ферментного электрода можно рассматривать как
пятистадийный процесс, включающий: 1) подвод субстрата к поверхности
электрода; 2) диффузию субстрата через мембрану к активному центру; 3)
реакцию в активном центре; 4) перенос продукта ферментативной реакции
через мембрану к поверхности электрода; 5) определение продукта вблизи
поверхности электрода. Первая стадия - подвод субстрата-сильно зависит от
скорости перемешивания раствора. Интенсивное перемешивание обеспечивает
быстрый перенос субстрата к поверхности электрода. Если сделать мембрану
очень тонкой и использовать высокоактивный фермент, то 2-я и 4-я стадии
исключаются или оказывают минимальное влияние. Стадия 3 также является
очень быстрой, поэтому время отклика ферментного электрода теоретически
должно быть близким к времени отклика базового электрода. Многие
исследователи приводят экспериментальные данные, показывающие, что это
достижимо при использовании тонкой мембраны и быстром перемешивании.
9.4. Методика изготовления типичного электрода
Берут базовый электрод (выбранный из табл. 9.1) и переворачивают его
рабочим корцом вверх (рис. 9.1, б). Покрывают мембраной из кусочка стенки
кишки поросенка (фирма Universal Sensors, Нью-Орлеан, США). Мембрану
смачивают 30 мкл 25%-ного раствора альбумина, затем добавляют фермент (в
количестве, соответствующем 10 ед. активности), растворив его в растворе
альбумина. Добавляют 5 мкл 25%-ного раствора глутарового альдегида для
завершения иммобилизации и дают мембране высохнуть. Далее закрывают
сенсор диализной мембраной (целлофан толщиной 20-25 мкм фирм Will
Scientific, Arthur Thomas, Sigma и др.), размером примерно вдвое больше
диаметра электрода. Надевают на целлофановую мембрану резиновое • кольцо
с диаметром, точно соответствующим размеру электрода, и осторожно
надвигают его на корпус электрода, так чтобы фермент лежал тонким
однородным слоем на рабочей поверхности электрода. Электрод помещают на
ночь в буферный раствор, с тем чтобы раствор проник к ферменту и вытеснил
захваченный воздух. Хранить электрод необходимо в буферном растворе
(оптимальном для данной ферментной системы) на холоду.
9.4.1. Аппаратура
Готовый ферментный электрод используют подобно любому ионоселективному
электроду. Потенциометрические датчики, например на мочевину,
аминокислоты, пенициллин, соединяют непосредственно с цифровым
милливольтметром (Orion, Corning, Sargent, Amel и др.) Показания
милливольтметра для каждой пробы представляют в виде зависимости от
логарифма концентрации.
Вместе с ферментным электродом используют электрод сравнения, обычно
каломельный. Электрод сравнения может быть конструкционно объединен с
ферментным электродом, как, например, в случае NH3-, С02- и 02-
электродов, используемых в качестве базовых в сенсорах мочевины,
аминокислот, глюкозы или спирта.
Наконец, электрод должен быть помещен в раствор, перемешиваемый с
постоянной скоростью, поскольку ее изменение может вызвать изменение
измеряемого электродного потенциала.
122
Г.шва 9
Элехтпрод
Найлоновсся
сетка
Ферментный Диализная
гелевый слой мембрана
а
Рис. 9.1. Изготовление ферментных электродных датчиков: а-физическое
удерживание: б-химически связанные ферменты.
9.5. Рабочие характеристики электродов
В табл. 9.2 перечислены некоторые ферментные электроды, предназначенные
для анализа обычных субстратов, и приведены их основные характеристики.
Полный перечень существующих электродов можно найти в книге Гилболга
[16].
В некоторых случаях можно использовать разные базовые электроды.
Например, для мочевинного датчика можно использовать катионоселективный
электрод и определять концентрацию ионов NH4 , образующихся при гидролизе
мочевины в присутствии уреазы:
Мочевина-1>NH^ + НСЮ3 . (9.5)
В другом варианте используют электроды для определения NH3 (который
образуется при подщелачивании раствора по реакции ОН- + NH4 ->NH3 + Н20)
или С02 (образуется при подкислении раствора: Н+ + НС О] -" С02 + Н20).
Лучшим сенсором является МН3-элсктрод. характеризующийся высокой
