Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
измерения фраунго-феровской дифракции; 6: распределение интенсивности
рассеянного света (дифрактограмма Эйри). Диаметр дифракционных колец
обратно пропорционален диаметру частиц. Сама дифрактограмма не зависит от
положения частицы, и, следовательно, измерения можно проводить с
частицами, движущимися с любой скоростью.
34.3.2. Динамические методы светорассеяния
Выше были кратко описаны различные аналитические методы, в основе которых
лежит статическое рассеяние света на макромолекулах и частицах. Если,
однако, исследуемый ансамбль частиц представляет собой суспензию, то
частицы совершают броуновское движение и элементарные акты рассеяния на
каждой частице вносят свой вклад (на некотором расстоянии от самой
частицы) в результирующую интенсивность и фазу рассеянного света.
Поскольку броуновское движение частиц неупорядочено, наблюдаемая на
расстоянии интенсивность рассеянного света флуктуирует во времени;
характерные времена флуктуаций интенсивности несут информацию о размерах
частиц и распределении их размеров. Эго является основой динамического
метода светорассеяния, или спектроскопии интенсивности флуктуаций
(известного также как спектроскопия квазиупругого рассеяния света,
СКУРС). Анализ характерных времен флуктуаций интенсивности проводят с
помощью электронных процессоров для обработки сигналов, получая в
результате распределение размеров частиц и т. д. Если в качестве
процессора используют коррелятор фотонов, как сейчас обычно и делают, то
метод называется фотонно-корреляционной спектроскопией (ФКС).
544
Глава 34
Существует также другая разновидность динамического метода
светорассеяния, которая может быть пригодна для сенсоров, например для
измерения скоростей потоков жидкостей. В этом варианте, известном как
лазерная доплеровская скорости-метрия (ЛДСМ), жидкость, содержащую
макромолекулы или суспендированные частицы, зондируют одним или
несколькими лазерными пучками. Геометрия лазерных пучков и систем
детектирования света зависит от природы исследуемого образца. Этот вопрос
будет обсуждаться ниже. Скорость движущихся частиц определяют по
характерным временам флуктуаций интенсивности.
Упомянутые здесь новые мощные методы потенциально являются весьма ценными
для изучения биологических макромолекул и частиц. И хотя они разработаны
сравнительно недавно и неизвестны большинству биотехнологов, уже имеется
несколько серийно выпускаемых приборов, которые начинают применяться в
биологических исследованиях.
34.3.2.1. Фотонно-корреляционная спектроскопия. Этот метод в настоящее
время хорошо разработан и широко используется. Он основан на том (рис.
34.3), что непрерывный лазерный луч видимого света пропускают через
суспензию макромолекул или частиц, находящихся в броуновском движении.
Часть излучения лазера рассеивается частицами, рассеянный свет собирают
линзой и регистрируют фотодетектором, который генерирует электрический
сигнал, пропорциональный интенсивности детектируемого света.
Интенсивность рассеянного света флуктуирует с характерным временем,
которое определяется временем ее диффузии на расстояние, равное длине
волны света, зависящим в свою очередь от гидродинамического радиуса
частицы.
Электрический сигнал фотодетектора анализируют с помощью цифрового
процессора сигналов, называемого фотонным коррелятором. Коррелятор
рассчитывает средние значения сигнала, умноженного на самого себя при
различных временах запаздывания, и таким образом строится
автокорреляционная функция сигнала. Полученная автокорреляционная функция
обычно экспоненциально убывает с увеличением времени запаздывания. Время
запаздывания связано с размером рассеивающих свет макромолекул или
частиц. Детально анализируя экспоненциальные автокорреляционные функции,
можно построить функцию распределения частиц по размерам.
Математическое описание рассмотренного выше процесса обработки данных
можно вкратце представить следующим образом. Для сферических макромолекул
одного и того же размера, диффундирующих в результате броуновского
движения, корреляционная функция электрической составляющей рассеянного
света имеет вид
д(1'(т) = е( T)e(i(°0T) ;
где ?>,- коэффициент диффузии макромолекул; т-время запаздывания; К -
модуль вектора рассеяния, зависящий от угла наблюдения; со0-угловая
частота падающего света. Можно показать, что при наличии большого числа
рассеивающих частиц измеряемая автокорреляционная функция описывается
выражением
</2>(т) = 1 + В\да)(т)\2 = 1 + Яе(^2В<к2т)
и представляет собой экспоненциально затухающую зависимость. Величина Dt
связана с размером частиц уравнением Стокса Эйнштейна:
кТ
А =--------,
67TTl^h
где к -константа Больцмана; Т температура; ц-вязкость и Rb
гидродинамический радиус макромолекулы. Таким образом, Rh можно
непосредственно оценить из значений автокорреляционной функции.
Рассеяние лазерного света
545
Рис. 34.3. Фотонно-корреляционная спектроскопия. а: схема
расположения компонентов
