Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
34.3. Методы, основанные на рассеянии света
Существует большое число методов, в которых рассеяние света используется
в аналитических целях. Такие методы удобно разделить на две группы: 1)
статические методы, в которых непосредственно измеряют интенсивность
рассеянного света, и 2) динамические методы, в которых измеряют
флуктуации интенсивности рассеянного света, в принципе не зависящие от
абсолютной или относительной интенсивности рассеяния.
34.3.1. Статические методы светорассеяния
Статические методы светорассеяния давно известны в биохимии,
микробиологии и других биологических дисциплинах. Такие методы, как
турбидиметрия, нефелометрия, угловое или дифференциальное рассеяние света
и т.д., достаточно хорошо описаны в литературе и являются обычными
методами рутинного анализа биологических объектов. Поэтому нет
необходимости детально рассматривать их здесь. Несмотря на то что многие
аспекты рассеяния света до сих пор изучены плохо (например проблема
произвольной формы [39, 107, 11]), рассеяние света является важным
средством определения размеров частиц [4, 5] и изучения их свойств.
542
Глава 34
Теоретические и практические аспекты рассеяния света клетками и
субклеточными частицами довольно полно рассмотрены в [66], а в работах
[62, 63] дан обширный обзор рассеяния света бактериями и подобными им
частицами. Принципы светорассеяния широко используют, например, при
изучении морфологии ядер и клеток методом проточной цитометрии (измеряют
рассеяние света вдоль и перпендикулярно потоку [91]), для обследования
эпидермальных клеток гониометрическими методами [16], лазерного контроля
деформации эритроцитов [78]. Лазеры широко используют также для быстрого
скрининга мочи на наличие в ней бактерий (бактериурия) нефелометрическим
методом [6].
Методы рассеяния лазерного излучения под большими и малыми углами можно
использовать при исследовании таких малых частиц, как лизосомы [59], или
для разработки новых методов изучения микробных популяций, например
метода углового или дифференциального светорассеяния [113, 114]. Более
современные методы, как, например, метод круговой интенсивности
дифференциального рассеяния света [85], развиваются из хорошо известных
методов светорассеяния, в данном случае метода кругового дихроизма (см.,
например, [65]), и уже воплощены в серийно выпускаемых приборах (фирмой
Mesa Diagnostics Inc., Сан-Диего) для клинических микробиологических
исследований. Здесь следует упомянуть также методы электрического
дихроизма и двойного лучепреломления [74], используемые для изучения
ориентированных в электрическом поле частиц. Такие методы широко
использовали для изучения ДНК, например в работах [23, 115-117].
Лазеры применяют также при изучении комбинационного рассеяния и рассеяния
Мандельштама -Бриллюэна [118]. Последнее возникает в результате
взаимодействия монохроматического (лазерного) излучения с
термоакустическими флуктуациями в исследуемом веществе. Рассеяние
Мандельштама - Бриллюэна и его использование для анализа биологических
систем обсуждается в работе [84]. Комбинационное рассеяние наблюдается
при взаимодействии когерентного лазерного света с веществом, что приводит
к сдвигу частоты рассеянного света, содержащему информацию о молекулярных
колебаниях в исследуемом образце. Спектроскопию комбинационного рассеяния
используют для изучения многих биомолекул in vitro [79, 100], а с
недавнего времени - и интактных клеток [57].
Еще один метод используется прежде всего для дисперсионного анализа
минерального вещества (например, продуктов сгорания топлива, выхлопных
газов) с размером частиц больше 1 мкм - это дифракционное рассеяние
света, обычно рассматриваемое в рамках приближения Фраунгофера. Этот
метод как потенциально полезный для биотехнологии заслуживает более
детального обсуждения. При дифракционном рассеянии света расширенный
параллельный пучок лазерного излучения проходит через ансамбль
неподвижных или движущихся макромолекул или частиц. Пространственное
распределение энергии дифрагированного света анализируют с помощью
дыфракто-граммы Эйри, представляющей собой распределение интенсивности
рассеянного света, которое регистрируют на обратной фокальной плоскости
линзы, расположенной симметрично па оси пучка и сфокусированной па
бесконечность (рис. 34.2). Для монодиспсрспого образца с радиусом частиц
а имеем
0,61 Xf
а =------,
г
где X-длина волны падающего пучка; /'-фокусное расстояние линзы (Фурье) и
г-радиус первого кольца нулевой интенсивности дифрагированного света. Для
поли-дисперсных образцов распределение размеров рассчитывают через
преобразование бесселевой функции. Этим методом можно определять размеры
частиц от ~ 1 мкм до 1 мм, особенно при высокой концентрации [7, 8, 10,
71, 97].
Рассеяние лазерного света
543
Фокальная
плоскость
линзы
фокальной плоскости (диср-рактогратма Зйри)
Рис. 34.2. Фраупгоферовская дифракция, а: схема оптической установки для
