Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
индий образует исключительно прочный индекс с ДТПУ (К o6p = 1029Д
Рассматриваемый метод анализа относится к конкурентным методам с
фиксированным количеством антитела.
Методика вкратце состоит в следующем. Разделяют свободный и связанный
антиген; понижая pH, высвобождают индиевую метку из комплекса с ДТПУ;
индий определяют с помощью анодной импульсной растворяющей
вольтамперометрии. Метод в принципе весьма чувствителен.
4.4. Потенциометрический иммуиоаиализ
Эта область вызывает значительный интерес начиная с 1975 г., когда
Джаната [10] опубликовал свои наблюдения. Работа Джанаты базировалась на
предпосылке, что в водных растворах белки являются полиэлектролитами, и
поскольку антитело-это белок, связывание с антигеном должно влиять на его
электрический заряд. Поэтому разность потенциалов между рабочим
электродом с иммобилизованным антителом и электродом сравнения будет
зависеть от концентрации свободного антигена. В качестве модельной
системы Джаната использовал лектин конканавалин А, иммобилизованный на
поверхности электрода. При добавлении в раствор полисахарида
действительно наблюдалось изменение потенциала, но к сожалению, такой же
сигнал получался в отсутствие конканавалина А. Отклик овальбуминового
электрода на антитела к овальбумину составлял около 2 мВ относительно
электрода, содержащего иммобилизованные сывороточные белки. Эти
потенциометрические электроды склонны, однако, к неспецифическому
связыванию, и, судя по литературе, попытки их использовать не имели
особого успеха.
В работе [17] изучали аналогичную систему с электродом из титановой
проволоки, на котором иммобилизовали хорионовый гонадотропин человека
(hCG) или антитело к нему. В этом случае также обнаружены небольшие (< 5
мВ) изменения потенциала при добавлении соответствующего антитела либо
антигена. Таким образом, при прямом измерении разности потенциалов между
рабочим электродом и электродом сравнения чувствительность анализа
намного ниже, чем в случае амперометрического иммуноанализа с ферментными
метками. К аналогичному выводу пришли также авторы [2], исследуя
эффективность различных иммуноаналитических методов определения
сывороточного альбумина человека. Эти авторы использовали сходные
мембраны, содержащие и не содержащие антитела к сывороточному альбумину,
и нашли, что обе мембраны, как и ожидалось, обладают одинаковой
избирательностью. Использование же амперометрического иммуноферментного
анализа обеспечило значительно более высокую чувствительность, что имеет
первостепенное значение в иммуноанализе.
4.5. Иммуноанализ с использованием потенциометрических электродов
Несмотря на то что после работ Джанаты [10] были приведены исследования,
показывавшие низкую чувствительность потенциометрического иммуноанализа,
группой Рехнитца опубликовано значительное число работ, в которых
иммуноанализ
сочетается с обычными ионоселективными потенциометрическими электродами,
чувствительными к диоксиду углерода, аммиаку, калию. В ранних
исследованиях использовали также иодидный и фторидный электроды. Примером
может служить работа [7], в которой для повышения чувствительности
потенциометрического иммуноанализа наряду с мембранным электродом
использовали ферментную метку (аспарагиназу, аденозиндеаминазу или
уреазу), пришиваемую к антигену. Наилучшей меткой является, по-видимому,
аспарагиназа, поскольку на активность как уреазы, так и аденозин-
деаминазы влияет связывание с гаптеном. Этот метод иммуноанализа
применяли для определения кортизона в разбавленной крови человека или в
плазме. Метод является гетерогенным; антитела к иммуноглобулину (IgG)
кролика иммобилизуют на гранулах агарозы, чтобы отделить свободную метку
от связанной.
К счастью, потенциометрические методы иммуноферментного анализа не
обязательно являются гетерогенными по своей сути. Гомогенные методы
удобнее, чем гетерогенные, так как включают меньшее число операций.
Фононг и Рехнитц [6] описали метод гомогенного потенциометрического
иммуноферментного анализа для человеческого иммуноглобулина G с
использованием СО2-электрода. В этом методе получают конъюгат IgG,
меченный ферментом, и затем ингибируют активность последнего, связывая
конъюгат с антителами к IgG. Используемая ферментная метка,
хлоропероксидаза, несколько необычна. Это гем-содержащий фермент, который
катализирует ряд реакций галогенирования органических молекул в
присутствии пероксида водорода и соответствующего галогенида, например
бромирования (3-кетоадипиновой кислоты. Этот процесс сопровождается
образованием С02, что и используют в данном аналитическом методе:
-00ССН2СН2С( = 0)СН2С0СГ + Вг~ + Н202 + 2Н+ -> (4.8)
-> 00ССН2СН2С(=0)СН2Вг + 2НгО + со2.
Перед добавлением субстратов требуется выдержать пробу в течение 30 мин.
Предел обнаружения IgG составляет несколько мкг/мл. Это значительно ниже
обычного клинического диапазона концентраций IgG (8-14 мг/мл). Поэтому
перед анализом препараты приходится разбавлять, что также способствует
